
第2章染色体与DNA.ppt
134页第二章第二章染色体与染色体与DNADNA11. 1. 染色体的组成与结构染色体的组成与结构2. DNA2. DNA的的组成与组成与结构结构3. DNA3. DNA的复制的复制4. DNA4. DNA的修复的修复5. DNA5. DNA的重组的重组本章主要内容本章主要内容2染色质:染色质:真核间期核中真核间期核中由由DNADNA、组蛋白、非组蛋、组蛋白、非组蛋白及少量白及少量RNARNA所组成的复所组成的复合体直径约合体直径约1010~~15nm15nm染色体:染色体:染色体已被普染色体已被普遍用于指存在于病毒、细遍用于指存在于病毒、细菌、真核细胞及其细胞器菌、真核细胞及其细胞器内所含的核酸分子内所含的核酸分子存在方式:存在方式:DNADNA须经高须经高度压缩度压缩,即形成一定的高,即形成一定的高级结构后,才能装入类核级结构后,才能装入类核和核内1. 1. 染色体(染色体(Chromosome)Chromosome)的组成与结构的组成与结构 3 1.1 1.1 原核生物原核生物(prokaryote)(prokaryote)的的染色体染色体由由DNADNA和组蛋白和组蛋白样碱性蛋白质样碱性蛋白质(即(即DNADNA结合蛋结合蛋白)所组成的白)所组成的复合物复合物DNADNA结合蛋白结合蛋白IIII的二聚体的二聚体富含精氨酸的臂富含精氨酸的臂4((1 1)结构简练:)结构简练:整个染色体整个染色体整个染色体整个染色体DNADNADNADNA几乎全部由功能几乎全部由功能几乎全部由功能几乎全部由功能基因与调控序列所组成。
基因与调控序列所组成基因与调控序列所组成基因与调控序列所组成 ((2 2)存在多顺反子)存在多顺反子mRNAmRNA的转录单元的转录单元3 3)存在重叠基因:同一段)存在重叠基因:同一段DNADNA编码不同的蛋白编码不同的蛋白质 原核生物中一般只有一条染色体且大都带有原核生物中一般只有一条染色体且大都带有原核生物中一般只有一条染色体且大都带有原核生物中一般只有一条染色体且大都带有单拷贝基因,只有很少数基因(如单拷贝基因,只有很少数基因(如单拷贝基因,只有很少数基因(如单拷贝基因,只有很少数基因(如rRNArRNArRNArRNA基因)是基因)是基因)是基因)是以多拷贝形式存在的以多拷贝形式存在的以多拷贝形式存在的以多拷贝形式存在的 E.coliE.coli的的DNADNA双链长达双链长达1.1-1.4mm1.1-1.4mm,是菌体长,是菌体长度的度的10001000倍 l 原核生物基因组的特点原核生物基因组的特点5l原核原核基因重叠的方式基因重叠的方式: : 1 1)一个基因完全存在于另一个基因内)一个基因完全存在于另一个基因内2 2)部分重叠)部分重叠3 3)两个基因只有一个碱基对的重叠)两个基因只有一个碱基对的重叠B在在A内,内,E在在D内;内;K与与C部分重叠;部分重叠;D的终止密码的最后一个碱基是的终止密码的最后一个碱基是J起始密码的第一个碱基起始密码的第一个碱基§采莲人在绿杨津,采莲人在绿杨津,§在绿杨津一阙新;在绿杨津一阙新;§一阙新歌声漱玉,一阙新歌声漱玉,§歌声漱玉采莲人。
歌声漱玉采莲人61.2 1.2 真核生物染色体的组成真核生物染色体的组成化学成分化学成分化学成分化学成分 作用作用作用作用 含量含量含量含量 DNADNADNADNA 遗传信息的载体遗传信息的载体遗传信息的载体遗传信息的载体 30%30%30%30% 组蛋白组蛋白组蛋白组蛋白 参与核小体的组成参与核小体的组成参与核小体的组成参与核小体的组成 与与与与DNADNADNADNA质量相当质量相当质量相当质量相当非组蛋白非组蛋白非组蛋白非组蛋白 参与染色质结构调节参与染色质结构调节参与染色质结构调节参与染色质结构调节 2/32/32/32/3组蛋白量组蛋白量组蛋白量组蛋白量少量的少量的少量的少量的RNARNARNARNA 少于少于少于少于10% DNA10% DNA10% DNA10% DNA量量量量 非组蛋白非组蛋白非组蛋白非组蛋白主要包括酶类及与细胞分裂有关的各主要包括酶类及与细胞分裂有关的各种蛋白质,如种蛋白质,如HMGHMG蛋白(可能与蛋白(可能与DNADNA超螺旋结构有关)超螺旋结构有关)、、 DNADNA结合蛋白(可能是与结合蛋白(可能是与DNADNA复制和转录有关的复制和转录有关的酶或调节物)、酶或调节物)、A A2424等等l 染色体的组成染色体的组成7l 组蛋白的特性组蛋白的特性(1) (1) 进化上的极端保守性进化上的极端保守性 H H1 1 H H2 2A A、、H H2 2B HB H3 3 、、H H4 4,,(2) (2) 无组织特异性无组织特异性(3) (3) 肽链氨基酸分布的不对称性肽链氨基酸分布的不对称性(4) (4) 组蛋白的可修饰性。
组蛋白的可修饰性在细胞周期的特定时间可在细胞周期的特定时间可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADPADP核糖基化等核糖基化等修饰的意义:使染色质结构发生改变,使其它调修饰的意义:使染色质结构发生改变,使其它调控蛋白易于和染色质相互接触,从而间接影响转控蛋白易于和染色质相互接触,从而间接影响转录活性5) H(5) H5 5组蛋白的特殊性组蛋白的特殊性8 核小体是由核小体是由H H2 2A A、、H H2 2B B、、H H3 3、、H H4 4各两个分子各两个分子生成的八聚体和由大约生成的八聚体和由大约200bpDNA200bpDNA组成的八聚组成的八聚体在中间,体在中间,DNADNA分子盘分子盘绕在外,而绕在外,而H H1 1则在核小则在核小体的外面每个核小体体的外面每个核小体只有一个只有一个H H1 1Ø 核小体核小体9Ø 核小体组成的实验证明核小体组成的实验证明核酸酶的轻微处理核酸酶的轻微处理核酸酶的广泛处理核酸酶的广泛处理凝胶电泳结果凝胶电泳结果10染色体染色体DNADNA核小体核小体螺线体螺线体超螺线体超螺线体超螺线体超螺线体66. .8倍8倍6倍6倍40倍40倍5倍5倍约1万倍约1万倍Ø 染色体形成过程中的长度变化染色体形成过程中的长度变化染色体形成过程中的长度变化染色体形成过程中的长度变化11染色体染色体的组装的组装从从DNA到到染色体染色体不论是形态还是长度都相差很大。
不论是形态还是长度都相差很大人类人类最长最长的第一个染色体全长仅的第一个染色体全长仅10μm ,但其,但其DNA却长达却长达7.2cm122. DNA2. DNA的组成与结构的组成与结构2.1 DNA2.1 DNA的一级结构的一级结构2.1.1 2.1.1 2.1.1 2.1.1 化学组成与基本单位化学组成与基本单位化学组成与基本单位化学组成与基本单位13• DNADNA和和RNARNA中的碱基中的碱基14• 碱基、核苷和核苷酸碱基、核苷和核苷酸15核苷酸核苷酸= =核苷核苷+ +磷酸磷酸• 单核苷酸的组成(举例)单核苷酸的组成(举例)16• 核苷酸单链的组成核苷酸单链的组成序列的书写规则序列的书写规则: : 5′ 3′5′ 3′;;5′5′端在左端在左, 3′, 3′端在右172.1.2 2.1.2 真核真核DNADNA序列的特点序列的特点• 单一序列单一序列( (非重复序列非重复序列) )• 中度重复序列中度重复序列• 高度重复序列高度重复序列18Ø 高度重复序列的高度重复序列的卫星卫星DNADNA卫星卫星DNADNA,占,占1010--60%60%,重复次数达,重复次数达数百万次,不转录数百万次,不转录,多位于着丝粒处,多位于着丝粒处,是异染色质组分,是异染色质组分,可能与染色体稳,可能与染色体稳定有关。
定有关19Ø 中度重复序列中的特殊成分中度重复序列中的特殊成分中度重复序列中的特殊成分中度重复序列中的特殊成分 — AluAlu家族家族AluAlu家族家族: : 哺乳动物和人类基因组中含量最丰富的一哺乳动物和人类基因组中含量最丰富的一种中度重复序列,长约种中度重复序列,长约300bp300bp,在单倍体基因组中重,在单倍体基因组中重复达复达3030万万-50-50万次因在其万次因在其170bp170bp处有一个限制性内处有一个限制性内切酶切酶AluAlu的酶切位点(的酶切位点(AGAG↓↓CTCT)) 而得名•重复单位长约重复单位长约300bp300bp;•重复单位内有一Alu(限制性内切酶)的识别和切识别和切割位点割位点AGCTAGCT,被切成170bp和130bp两个片段;•3 3’’- -端有富含端有富含A A的序列;•两端有两端有7 7~~20bp20bp的正向重复的正向重复作为分界,这部分与简单序列重复(卫星)DNA非常相似;不同的Alu成员的侧翼重复顺序各不相同下面是人类gDNA中的两个Alu成员:GTTTAGATAAGTTTAGATAA……AGCTAGCTAGCTAGCT……A A2525GTTTAGATAAGTTTAGATAAAAAAAAGAAAGAAATGGTGG……AGCTAGCTAGCTAGCT……A A2525( (GAAAGAAA) )2 2NANA4 4GAGA5 5GAGA6 6GAAAGAAAAAATAAATGGAAATAAATGG202.1.3 2.1.3 三种常见的三种常见的DNADNA短重复序列类型短重复序列类型l 反向重复反向重复((inverted repeat)inverted repeat)::由反方向互补的两由反方向互补的两个个DNADNA片段组成。
两个反转重复序列又叫片段组成两个反转重复序列又叫回文序列回文序列(palindrome sequence),(palindrome sequence),反转重复反转重复l 镜像重复镜像重复(mirror repeat)(mirror repeat)::由反方向完全相同由反方向完全相同的两个序列组成的两个序列组成l 直接重复直接重复(direct repeat)(direct repeat)::由同一方向完全相同的由同一方向完全相同的两个序列组成也叫两个序列组成也叫正向重复正向重复序列、序列、顺向重复顺向重复序列21反向重复(回文序列)反向重复(回文序列)书书临临汉汉字字翰翰林林书书画画上上荷荷花花和和尚尚画画22较长的回文结构较长的回文结构(单链)单链),,可形成可形成茎环结构茎环结构(发夹结构发夹结构)23较长的回文结构较长的回文结构(双链),可形成双链),可形成十字形结构十字形结构24判断判断25镜象重复镜象重复26Ø C-C-值矛盾值矛盾• C-C-值:值:指物种单倍体基因组指物种单倍体基因组DNADNA的总量• C-C-值悖理(值悖理(C-value paradox)C-value paradox),,C-C-值矛盾:值矛盾:某些某些物种物种C-C-值大小与其进化复杂性程度之间不呈对应关值大小与其进化复杂性程度之间不呈对应关系的现象,即某些低等生物却具有较大的系的现象,即某些低等生物却具有较大的C C值。
值272.1.4 DNA2.1.4 DNA一级结构的测定一级结构的测定282930桑桑格格法法序序列列分分析析的的原原理理酶酶反反应应电电泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT3´5´GG5´3´引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC3´5´TCAACGATGG5´3´读出模板读出模板互补序列互补序列读出模板读出模板序列序列31Ø DNADNA的双螺旋结构模型的双螺旋结构模型2.2 DNA2.2 DNA二级结构二级结构322.2.1 2.2.1 几个概念几个概念l DNADNA结构多态性:结构多态性:由于结构参数存在一定的差由于结构参数存在一定的差异,而使异,而使DNADNA呈现为呈现为B-DNAB-DNA、、A-DNAA-DNA以及以及Z-DNAZ-DNA等不等不同同构象类型构象类型的现象。
的现象 l DNADNA构象家族:构象家族:每一类型的每一类型的DNADNA((A-DNA A-DNA 、、B-B-DNADNA或或Z-DNAZ-DNA),并非只代表单一的构象,而是代),并非只代表单一的构象,而是代表了一组相关的构象表了一组相关的构象l 结构参数:结构参数:指螺旋走向、每匝碱基对数、相邻指螺旋走向、每匝碱基对数、相邻碱基对轴向距离、碱基平面与螺旋轴之夹角等碱基对轴向距离、碱基平面与螺旋轴之夹角等 33ABZ碱基倾角碱基倾角( (°) 20 6 4) 20 6 4碱基间距碱基间距(nm) 0.26 0.34 0.37(nm) 0.26 0.34 0.37螺旋直径螺旋直径(nm) 2.6 2.0 1.8(nm) 2.6 2.0 1.8每匝碱基数每匝碱基数 11 10 1211 10 12螺旋方向螺旋方向 右右 右右 左左Ø 不同螺旋形式不同螺旋形式DNA分子的主要参数的比较分子的主要参数的比较 A-DNA B-DNA Z-DNAA-DNA B-DNA Z-DNA34A-DNA B-DNA Z-DNAA-DNA B-DNA Z-DNA35Ø DNADNA二级结构的多态性二级结构的多态性 类型:类型: A B C D E ZA B C D E Z螺旋方向(手性)螺旋方向(手性) 右右 右右 右右 右右 右右 左左相对湿度:相对湿度: 75% 92% 66%75% 92% 66% 目前尚无证据说明生物体内有目前尚无证据说明生物体内有C-DNAC-DNA存在。
存在D D、、E E构象仅适用于缺少构象仅适用于缺少G-CG-C对的对的DNADNA分子 362.2.2 DNA2.2.2 DNA二级结构的特点二级结构的特点((1 1))A-DNAA-DNA::A-DNAA-DNA包括包括DNA-RNADNA-RNA、、RNA-RNARNA-RNA2 2))B-DNAB-DNA::近似于近似于WastonWaston-Crick-Crick的的DNADNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型3 3))Z-DNAZ-DNA::左旋锯齿形左旋锯齿形DNADNA• Z-DNAZ-DNA的功能:的功能:可能与基因表达的调控有关可能与基因表达的调控有关• B-DNAB-DNA向向Z-DNAZ-DNA转化的因素:转化的因素:胞嘧啶胞嘧啶C C5 5的甲基化;阳离子的的甲基化;阳离子的结合;结合;Z-DNAZ-DNA结合蛋白;负超螺旋结合蛋白;负超螺旋• B-DNAB-DNA向向A-DNAA-DNA的转化的转化::B-DNA --B-DNA --(部分脱水)(部分脱水)→ → A-DNA A-DNA 在生理状态下,在生理状态下,B-DNAB-DNA、、A-DNAA-DNA和和Z-DNAZ-DNA可能处在可能处在一个动态平衡之中。
一个动态平衡之中 螺旋结构的稳定因素:碱基堆积力;螺旋结构的稳定因素:碱基堆积力;氢键氢键;与;与正离子、正离子、亚精胺亚精胺和组蛋白等的结合和组蛋白等的结合37T==A38C≡≡G39Ø大沟的生物学作用大沟的生物学作用 大沟是大沟是蛋白因子的主要识别部位;与蛋白因子的主要识别部位;与DNADNA形成形成三级结构及基因表达调控有关三级结构及基因表达调控有关可能形成氢键的基团在大、小沟中的分布可能形成氢键的基团在大、小沟中的分布大沟大沟 大沟大沟小沟小沟 小沟小沟A - TA - TG - CG - C40Ø DNADNA结合蛋白与结合蛋白与DNADNA之间的相互作用之间的相互作用相对来说,大沟能够提供更多的用于形成氢键的信息412.3 DNA2.3 DNA的高级结构的高级结构2.3.1 DNA2.3.1 DNA超超螺旋螺旋Ø DNADNA超螺旋及其种类超螺旋及其种类l 超超螺旋螺旋::是当是当双股螺旋双股螺旋进进一步盘一步盘绕和扭曲时绕和扭曲时所形成的高级结构。
所形成的高级结构l 超超螺旋种类螺旋种类::正正超螺旋和负超超螺旋和负超螺旋双螺旋螺旋的的松缠将导松缠将导致形成负超螺旋;致形成负超螺旋;而而双螺旋双螺旋的的拧紧拧紧则导致形成正超螺旋则导致形成正超螺旋 超螺旋是超螺旋是DNADNA三级结构的一种普遍形式天三级结构的一种普遍形式天然的然的DNADNA都呈负超都呈负超螺旋42质粒质粒DNADNA的琼脂糖凝胶电泳图谱示意图的琼脂糖凝胶电泳图谱示意图Ø DNA超螺旋结构对其电泳迁移率的影响超螺旋结构对其电泳迁移率的影响43 DNADNA上述结构的变化可用数学式来表示:上述结构的变化可用数学式来表示: L = T + WL = T + WL L::连接数(连接数(Linking numberLinking number),), DNADNA两条链间交叉的两条链间交叉的次数 T T::盘绕数(盘绕数(twisting numbertwisting number),一条链沿螺旋轴所形),一条链沿螺旋轴所形成的初级螺旋的周数成的初级螺旋的周数 W W::扭曲数(扭曲数(writhing numberwrithing number),即超螺旋数。
即超螺旋数44Ø 超超螺旋的意螺旋的意义义::((1 1)使)使DNADNA体积变小体积变小使使DNADNA形成高度致密的状态,形成高度致密的状态,从而得以容纳于有限的空间从而得以容纳于有限的空间中2 2)利于)利于DNADNA双链双链分开或局部分开或局部熔链DNADNA特定区域中特定区域中超螺旋结构的增加有助于超螺旋结构的增加有助于DNADNA的结构的结构变化,如复制和变化,如复制和转录的启动等转录的启动等Ø DNADNA超螺旋的产超螺旋的产生生:: 细胞内所细胞内所有有DNADNA超螺旋都是超螺旋都是由由DNADNA拓扑异构拓扑异构酶的催酶的催化作用而产化作用而产生的452.3.2 DNA2.3.2 DNA拓扑异构酶拓扑异构酶l 拓拓扑异构酶扑异构酶::催催化化DNADNA拓扑异构体(拓扑异构体(topoisomertopoisomer))相互转化的酶(相互转化的酶(topoisomerasetopoisomerase)Ø 催化反应:催化反应:DNADNA链的断裂和连接链的断裂和连接共价催化共价催化Ø 分类:分类: ⅠⅠ型型 ⅡⅡ型型 每每次作用于次作用于1 1条条DNADNA链链 作作用于用于2 2条条DNADNA链链 不不需需ATP ATP 需需要要ATPATP L L每次改变数为每次改变数为1 L1 L每次改变数为每次改变数为2 2 原、真核生物的拓扑异构酶都参与原、真核生物的拓扑异构酶都参与DNADNA的复制、的复制、转录和重组过程。
转录和重组过程46Ø DNADNA超螺旋的形成超螺旋的形成 拓扑异构酶拓扑异构酶 拓扑异构酶拓扑异构酶 负超螺旋 负超螺旋 松驰型松驰型DNA DNA 正超螺旋正超螺旋 溴乙锭溴乙锭 溴乙锭溴乙锭 双螺旋分子的链间螺旋数发生变化(增多或减少几圈),DNA分子内部产生额外的张力而使分子内部原子空间位置重排 拓扑异构酶与DNA共价结合形成蛋白质-DNA中间体,在其磷酸二酯键处造成暂时性裂口,使DNA的多核苷酸链得以穿越,从而改变分子的拓扑状态47Ø ⅠⅠ型拓扑异构酶作用机理型拓扑异构酶作用机理 ⅠⅠ型酶首先结合于型酶首先结合于DNADNA,使该处的,使该处的DNADNA熔解,熔解,随后与单链区形成酶随后与单链区形成酶—DNA—DNA复合物;切割复合物;切割DNADNA双股双股中的一股,与切割点的中的一股,与切割点的5ˊ-P5ˊ-P形成磷酯酰酪氨酸;形成磷酯酰酪氨酸;DNADNA的另一股链穿越切割点,而断裂的链重新连的另一股链穿越切割点,而断裂的链重新连接,酶被释放。
接,酶被释放48大肠杆菌大肠杆菌topotopo I: I: 消除负超螺旋消除负超螺旋大肠杆菌大肠杆菌topotopo II II:产生负超螺旋:产生负超螺旋493. DNA3. DNA的复制的复制50Ø WatsonWatson和和CrickCrick的推测的推测半保留复制半保留复制::双链双链DNADNA在复在复制时制时, , 两条单链分开,两条单链分开,分分别别以每一条单链做模板以每一条单链做模板, ,各各自合成一条新的自合成一条新的DNADNA单链,单链,这样新合成的子代双链这样新合成的子代双链DNADNA分子中分子中, , 一条一条单单链来自亲链来自亲代代DNADNA,另一条,另一条单单链是新合链是新合成的DNADNA半保留复制意义半保留复制意义::保证保证亲代的遗传信息稳定地传亲代的遗传信息稳定地传递给后代递给后代51Semi-conservative Conservative Dispersive52 Matthew Matthew MesselsonMesselson Franklin Stahl Franklin Stahl 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制(实验验证)Ø DNADNA半保留复制的实验验证半保留复制的实验验证53“Heavy” DNA“Hybrid” DNA“light” DNA “Hybrid” DNA54 l 几个概念几个概念• 复制原点复制原点: 特定的特定的复制起始点复制起始点ori(或或o)), 长长100~~200bp, 富含富含A、、T。
被特定的蛋白因子所识别被特定的蛋白因子所识别 质粒、细菌染色体、噬菌体和其它病毒通常有一质粒、细菌染色体、噬菌体和其它病毒通常有一个复制起始点,而真核的则有多个复制起始点个复制起始点,而真核的则有多个复制起始点• 复制子复制子((replicon):即):即1个复制单位,包括复制个复制单位,包括复制原点在内的一组基因及其控制下的原点在内的一组基因及其控制下的DNA区段原核区段原核DNA构成一个复制子,而真核的则构成多个构成一个复制子,而真核的则构成多个• 复制叉复制叉:复制时,解链酶等先将:复制时,解链酶等先将DNA的一段双链的一段双链解开,形成复制点,这个复制点的形状象一个叉子,解开,形成复制点,这个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉故称为复制叉55• 半不连续复制半不连续复制::DNADNA复制时其中一条子链的合成复制时其中一条子链的合成是连续的,而另一条子链的合成是不连续的是连续的,而另一条子链的合成是不连续的• 前导链:前导链:指指在在DNADNA复制时,其延伸方向与复制叉复制时,其延伸方向与复制叉移动方向一致并连续合成的链移动方向一致并连续合成的链• 滞后链:滞后链:指其延伸指其延伸方向与复制叉移动方向相反,方向与复制叉移动方向相反,首先形成许多不连续的片段首先形成许多不连续的片段( (冈崎片段冈崎片段) ),最后再,最后再连成一条完整链的连成一条完整链的DNADNA单链。
单链l 几个概念几个概念563.1 3.1 原核和真核细胞原核和真核细胞染色体染色体DNADNA复制的特点复制的特点1 1))半保留复制半保留复制(从(从DNADNA复制的结果)复制的结果)2 2))半不连续复制半不连续复制(从新生单链合成的过程)(从新生单链合成的过程)3 3))双向复制双向复制(从复制叉延伸的方向)(从复制叉延伸的方向)573.2 3.2 原核细胞染色体原核细胞染色体DNADNA的复制的复制3.2.1 3.2.1 复制的起始复制的起始 Ø 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA的复制原点(的复制原点(oriCoriC))58 大约大约2020个个DnaADnaA蛋白在蛋白在ATPATP的作用下与的作用下与oriCoriC处的处的4 4个个9bp9bp保守序列相结合保守序列相结合59 在在HUHU蛋白和蛋白和ATPATP的共同作用下的共同作用下, ,DnaDna复制起始复制起始复合物使复合物使3 3个个13bp13bp直接直接重复序列变性重复序列变性, ,形成开链形成开链 60 解链酶六聚体分别与单链解链酶六聚体分别与单链DNADNA相结合相结合( (需需DnaCDnaC帮助帮助),),进一步解开进一步解开DNADNA双链双链61 1 1))DNA DNA 拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA (DNA TopoisomeraseTopoisomerase) ):: 拓扑异构酶拓扑异构酶І::使使DNADNA一条链发生断裂和再连接,作一条链发生断裂和再连接,作用是松解负超螺旋。
主要集中在活性转录区,用是松解负超螺旋主要集中在活性转录区,同转同转录有关录有关例如:大肠杆菌中的例如:大肠杆菌中的ωω蛋白蛋白 拓扑异构酶拓扑异构酶ΠΠ::该酶能暂时性地切断和重新连接该酶能暂时性地切断和重新连接双链双链DNADNA,作用是将,作用是将负超螺旋引入负超螺旋引入DNADNA分子分子同复制同复制有关有关例如:大肠杆菌中的例如:大肠杆菌中的DNADNA旋转酶(旋转酶(gyrasegyrase)3.2.2 3.2.2 参与大肠杆菌染色体参与大肠杆菌染色体DNADNA复制的主要蛋白因子复制的主要蛋白因子623 3))单链结合蛋白单链结合蛋白(SSBP-single-strand binding (SSBP-single-strand binding protein)protein)::稳定已被解开的稳定已被解开的DNADNA单链、阻止复性、单链、阻止复性、保护单链不被核酸酶降解保护单链不被核酸酶降解 2 2))DNA DNA 解螺旋酶解螺旋酶 / /解链酶解链酶((DNA DNA helicasehelicase) )::通过水解通过水解ATPATP获得能量来解开双链获得能量来解开双链DNADNA。
E. coliE. coli中的解螺旋酶中的解螺旋酶RepRep沿前导链模板沿前导链模板的的3ˊ3ˊ5ˊ5ˊ移动,而解螺旋酶移动,而解螺旋酶( (DnaB)IDnaB)I、、IIII、、IIIIII沿后随链模板的沿后随链模板的5ˊ5ˊ 3ˊ3ˊ移动运送和协同运送和协同DnaBDnaC解开解开DNA双链双链DnaBDnaA辨认起始点辨认起始点解螺旋酶解螺旋酶634 4)引物合成酶(引发酶):)引物合成酶(引发酶): 此酶以此酶以DNADNA为模板合成一段为模板合成一段RNA,RNA,这段这段RNARNA作作为合成为合成DNADNA的引物(的引物(Primer)Primer)该酶是一种特殊该酶是一种特殊的以的以DNADNA为模板的为模板的RNARNA聚合酶,是聚合酶,是DnaGDnaG基因的产基因的产物Ø冈崎片段的合成需要冈崎片段的合成需要RNARNA引物;前导链的合引物;前导链的合成也需要成也需要RNARNA引物ØDNADNA复制时使用复制时使用RNARNA引物的意义引物的意义: :提高提高DNADNA复制复制的保真性的保真性64Ø 染色体染色体DNADNA复制时复制时存在存在RNARNA引物的实验证明引物的实验证明65性质性质 聚合酶聚合酶ⅠⅠ聚合酶聚合酶ⅡⅡ聚合酶聚合酶ⅢⅢ3ˊ 5ˊ3ˊ 5ˊ外切活性外切活性+ ++ ++ +5ˊ 3ˊ5ˊ 3ˊ外切活性外切活性+ +- -- -5ˊ 3ˊ5ˊ 3ˊ聚合活性聚合活性+ + 中中+ + 很低很低+ + 很高很高新生链合成新生链合成- -- -+ +• 聚合酶聚合酶ⅢⅢ::DNADNA复制的主要聚合酶,其复制的主要聚合酶,其3 3ˊ ˊ 5 5ˊˊ外切外切活性的校对功能,提高了活性的校对功能,提高了DNADNA复制的保真性。
复制的保真性• 聚合酶聚合酶Ⅰ(Ⅰ(DNA DNA PolPol Ⅰ) Ⅰ),,KornbergKornberg酶酶: : 主要是对主要是对DNADNA损伤的修复;以及在损伤的修复;以及在DNADNA复制时切除复制时切除RNARNA引物并催化引物并催化DNADNA合成以填补切除合成以填补切除RNARNA引物后留下的缺口引物后留下的缺口• 聚合酶聚合酶ⅡⅡ::修复紫外光引起的修复紫外光引起的DNADNA损伤5 5)大肠杆菌的)大肠杆菌的DNADNA聚合酶聚合酶 是以是以DNADNA为模板的为模板的DNADNA合成酶合成酶((DdDpDdDp))催化反应时,以催化反应时,以dNTPdNTP为底物;需要为底物;需要DNADNA模板;需要模板;需要3 3 -OH-OH;新链合成方向为;新链合成方向为5 5 3 3 66E.coliE.coli 中的三种中的三种DNADNA多聚酶多聚酶67 聚合反应的基本聚合反应的基本过程都是通过新合成过程都是通过新合成的链的的链的3ˊ-OH3ˊ-OH对进入对进入的新的核苷三磷酸的新的核苷三磷酸(用(用d NTPd NTP)的)的 磷进磷进磷进磷进行亲核攻击行亲核攻击行亲核攻击行亲核攻击,导致磷,导致磷酯键断裂,结果在链酯键断裂,结果在链的的3ˊ3ˊ末端加上了一末端加上了一个新的核苷酸,即延个新的核苷酸,即延长了一个核苷酸。
长了一个核苷酸 释放出的焦磷酸释放出的焦磷酸经焦磷酸酶水解有利经焦磷酸酶水解有利于聚合反应的进行于聚合反应的进行68Ø KlenowKlenow片段片段 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA PolPol Ⅰ Ⅰ经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶处理后所得到的羧基端大片段白酶处理后所得到的羧基端大片段, ,具具5ˊ→ 3ˊ5ˊ→ 3ˊ聚聚合和合和3ˊ→ 5ˊ3ˊ→ 5ˊ外切功能外切功能在体外,曾用于在体外,曾用于DNADNA测序测序和和PCRPCR反应69• KlenowKlenow片段片段的结构的结构70• 大肠杆菌的大肠杆菌的DNA DNA PolPol III IIIØ PolPol Ⅲ Ⅲ 是一种非对称是一种非对称二聚体,二聚体,一个单体用于先一个单体用于先导链的合成,另一个用于导链的合成,另一个用于后随链的合成后随链的合成Ø 核心酶核心酶: : 由由αα、、θθ、、εε三个亚基构成,三个亚基构成,α α ::5ˊ- 3ˊ5ˊ- 3ˊ聚合 εε ::3ˊ-5ˊ3ˊ-5ˊ外切θθ::激发激发εε外切酶活性外切酶活性Ø延伸前导链和滞后链延伸前导链和滞后链. .Ø复制速率复制速率: :体内体内: 1000nt/sec: 1000nt/sec。
体外体外: 700nt/sec: 700nt/sec71Each catalytic core Each catalytic core of of PolPol Ⅲ synthesizes Ⅲ synthesizes a daughter strand. a daughter strand. DnaBDnaB is responsible is responsible for forward movement for forward movement at the replication at the replication fork.fork.Coordinating synthesis of the lagging and leading strands.7273 6 6))DNADNA连接酶(连接酶(19671967年发现):年发现): 若双链若双链DNADNA中一条链有切口,切口一端是中一条链有切口,切口一端是3ˊ-3ˊ-OHOH,,另一端是另一端是5ˊ-5ˊ-磷酸基,连接酶可催化这两端磷酸基,连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键,而使切口连接形成磷酸二酯键,而使切口连接。
DNADNA连接酶在连接酶在DNADNA复制、损伤修复、重组等过复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用程中起重要作用Ø连接酶基因的发现连接酶基因的发现 E. coliE. coli liglig基因突变,并不基因突变,并不导致导致DNADNA合成的终止,但引起冈崎片段的异常积累合成的终止,但引起冈崎片段的异常积累 3ˊ5ˊ3ˊ5ˊOHOHP P74• 连接酶的作用机制连接酶的作用机制 辅因子辅因子原核原核: NAD: NAD真核真核: ATP: ATP+753.2.3 DNA3.2.3 DNA的的复制过程(以大肠杆菌的为例)复制过程(以大肠杆菌的为例)•复制的起始复制的起始•解旋与解链:解旋与解链:ⅡⅡ型拓扑异构酶即型拓扑异构酶即DNADNA旋转酶,引入负超螺旋转酶,引入负超螺旋,抵消复制叉推进时所产生的正超螺旋解链酶消耗旋,抵消复制叉推进时所产生的正超螺旋解链酶消耗ATPATP,打开双链打开双链•RNARNA引物的合成:引物的合成:DNADNA引发酶结合到引发酶结合到DNADNA上并合成一段短的上并合成一段短的RNARNA引物,从而引发复制叉处先导链的复制。
引发体引物,从而引发复制叉处先导链的复制引发体((primosomeprimosome) ) 复合体在后随链模板上移动时,每隔复合体在后随链模板上移动时,每隔1000-1000-2000nt2000nt就合成就合成1 1个个RNARNA,用作合成冈崎片段的引物用作合成冈崎片段的引物•DNADNA链的延伸:链的延伸:前导链和后随链的引物都由前导链和后随链的引物都由DNA DNA PolPol Ⅲ Ⅲ延延伸即,前导链和冈崎片段的合成均由伸即,前导链和冈崎片段的合成均由DNA DNA PolPol Ⅲ Ⅲ催化•RNARNA引物的切除及引物切除后所留缺口的填补:引物的切除及引物切除后所留缺口的填补:由由DNA DNA PolPolⅠⅠ催化催化•岗崎片段的连接岗崎片段的连接•复制的终止复制的终止76 Ø 大肠杆菌大肠杆菌染色体染色体DNADNA复复制的终止制的终止 在与在与orioriC C约相对的位置约相对的位置, ,具有具有具有具有DNADNADNADNA复制终止位点复制终止位点复制终止位点复制终止位点-- -- -- -- 20bp20bp重复性终止子序列(重复性终止子序列(TerTer)),此处可以结合一种特异的蛋白,此处可以结合一种特异的蛋白,此处可以结合一种特异的蛋白,此处可以结合一种特异的蛋白质分子叫做质分子叫做质分子叫做质分子叫做Tus(Tus(Tus(Tus(tustus基因的产物基因的产物) ),这种蛋白质可能是通过抑,这种蛋白质可能是通过抑,这种蛋白质可能是通过抑,这种蛋白质可能是通过抑制解链酶制解链酶制解链酶制解链酶( ( ( (HelicaseHelicaseHelicaseHelicase) ) ) )的活性而终止复制的。
详细的机制还不的活性而终止复制的详细的机制还不的活性而终止复制的详细的机制还不的活性而终止复制的详细的机制还不完全清楚完全清楚完全清楚完全清楚复制结束时,两个子链仍是相扣的,它们由拓扑复制结束时,两个子链仍是相扣的,它们由拓扑异构酶解旋,结果子代异构酶解旋,结果子代DNADNA随着各自在细胞膜上的附着点移随着各自在细胞膜上的附着点移动而相互分离,分配到动而相互分离,分配到2 2个子细胞中个子细胞中77 一般每个细菌胞内只有一个核区,当细胞快速一般每个细菌胞内只有一个核区,当细胞快速生长时,由于生长时,由于DNADNA复制次数与细胞分裂次数不同步,复制次数与细胞分裂次数不同步,一个胞内可同时出现一个胞内可同时出现2 2个甚至个甚至4 4个核区 图78Ø DNADNA分子的复制分子的复制过程过程793.2.4 DNA3.2.4 DNA复制的其它方式复制的其它方式l 滚环型:滚环型:单向复制的一种特殊方式如:单向复制的一种特殊方式如:ΦΧΦΧ174174的双链环状的双链环状DNADNA复制型(复制型(RFRF)) 几个概念:几个概念:基因的基因的DNADNA正链正链 = = 有义链有义链 = = 编码链编码链 基因的基因的DNADNA负链负链 = = 反义链反义链 = = 模板链模板链 噬菌体基因组较小,是噬菌体基因组较小,是DNADNA复制研究的重要实验复制研究的重要实验系统。
其复制是在进入寄主细胞后,主要利用寄主系统其复制是在进入寄主细胞后,主要利用寄主的基因产物进行的的基因产物进行的 E. coliE. coli噬菌体噬菌体ΦΦ×174×174的基因组是一个含的基因组是一个含5386nt5386nt的单链环型的单链环型DNADNA复制时,首先合成的是其互复制时,首先合成的是其互补链补链, ,形成形成RFRF型双链分子型双链分子, ,然后再以滚环复制方式产然后再以滚环复制方式产生其基因组生其基因组DNADNA) DNA → RF →(+) DNA80Ø ФXФX174174以以(+)(+)链为模板链为模板合成合成RFRF型双链型双链DNADNA81Ø RFRF型型ФX ФX 174174滚环复制产生滚环复制产生(+)(+)链链l滚环复制过程及特点滚环复制过程及特点1 1)在正链的复制原点处切开在正链的复制原点处切开2 2)不需)不需RNARNA引物,以负链为模板,延伸正链引物,以负链为模板,延伸正链3 3)只有一个复制叉,单向复制只有一个复制叉,单向复制82l 复制型(复制型(RF))ΦΧ174双链双链环状环状DNA的滚环复制的滚环复制ΦΦ×174(-)×174(-)链合成是不连续的,链合成是不连续的,相当于相当于E. coliE. coli DNA DNA后随链的合后随链的合成,成,(+)(+)链的合成是连续的,相链的合成是连续的,相当于当于E. coliE. coli先导链的合成。
先导链的合成83lD-D-环复制环复制D-D-环复制环复制:单向复制的一种特殊类型单向复制的一种特殊类型PolγPolγ参与有两个单向复制叉有两个单向复制叉843.3.1 3.3.1 真核真核DNADNA聚合酶聚合酶 PolPol α β δ ε γ α β δ ε γ 存在部位存在部位 核核 核核 核核 核核 线粒体线粒体PolPol α α:可能主要负责:可能主要负责RNARNA引物的合成引物的合成PolPol β: β: 可能与可能与DNADNA修复有关修复有关PolPol γ γ:负责线粒体:负责线粒体DNADNA的复制PolPol δ δ:负责前导链和滞后链的合成:负责前导链和滞后链的合成 PolPol ε: ε: 与滞后链合成有关;可能参与去除与滞后链合成有关;可能参与去除RNARNA引物引物, , 并填补缺口;参与切除修复并填补缺口;参与切除修复3.3 3.3 真核真核DNADNA的复制特点的复制特点8586l 原核与真核染色体原核与真核染色体DNADNA复制的比较复制的比较873.3.2 3.3.2 端粒端粒DNADNA的复制的复制•端粒:端粒:真核染色体的末端结构。
真核染色体的末端结构•端粒的功能端粒的功能: : 保持染色体的稳定保持染色体的稳定•端粒端粒DNADNA的序列特点:的序列特点:一般含许多串联的短寡聚核苷一般含许多串联的短寡聚核苷酸序列,其一股链如为酸序列,其一股链如为TxGyTxGy,其互补链就为,其互补链就为CyAxCyAx,,x x和和y y在在1-41-4范围内端粒范围内端粒DNADNA序列具有一定的取向特征,在每序列具有一定的取向特征,在每一染色体的末端,富含一染色体的末端,富含G G的一股链由的一股链由5ˊ→3ˊ5ˊ→3ˊ方向延伸而方向延伸而成为一个由成为一个由1212~~16nt16nt构成的单链突起构成的单链突起•端粒酶:端粒酶:是一种含是一种含RNARNA的蛋白复合体的蛋白复合体, ,是一种特殊的逆转是一种特殊的逆转录酶所含录酶所含RNA(RNA(约长约长150nt)150nt)与端粒与端粒DNADNA末端的单链突起互末端的单链突起互补补, ,该该RNARNA可作为模板可作为模板, , 延长上述单链突起延长上述单链突起•端粒端粒DNADNA的复制的复制: : 尺蠖模型尺蠖模型88真核端粒真核端粒DNADNA复制的尺蠖模型复制的尺蠖模型89 3.4 3.4 逆转录病毒基因组的复制模式逆转录病毒基因组的复制模式逆转录逆转录酶酶具有以下催化活性:具有以下催化活性:((1 1))RNARNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性;聚合酶活性; ((2 2))DNADNA指导的指导的DNADNA聚合酶活性;聚合酶活性; ((3 3))RNaseHRNaseH的活性:专门降解的活性:专门降解RNA-DNARNA-DNA分子中的分子中的RNARNA。
逆转录酶逆转录酶((RNA-directed DNA polymeraseRNA-directed DNA polymerase))与与RNARNA聚聚合酶一样不具合酶一样不具3ˊ-5ˊ3ˊ-5ˊ外切酶活力体外主要用于外切酶活力体外主要用于cDNAcDNA((complementary DNAcomplementary DNA)的合成90Ø 逆转录病毒逆转录病毒 是一种真正的二倍体病毒,为正链是一种真正的二倍体病毒,为正链RNARNA病毒其基因产物的表达和后代病毒的产生,都必须通其基因产物的表达和后代病毒的产生,都必须通过过DNADNA中间体HIVHIV是是AIDSAIDS(爱滋病)的病原体爱滋病)的病原体1) (1) 基因组结构:含基因组结构:含2 2拷贝单链拷贝单链RNARNA和和2 2个个tRNAtRNA 逆转录病毒的基因组结构逆转录病毒的基因组结构基因基因gaggag,编码核心蛋白;,编码核心蛋白;polpol,编码逆转录酶和整合酶等;,编码逆转录酶和整合酶等;envenv,编码被膜蛋白编码被膜蛋白91Ø 逆转录过程逆转录过程 逆转录过程需逆转录过程需RdDpRdDp、、DdDpDdDp、、RNaseRNase H H和和RNARNA内切酶内切酶92Ø 逆转录病毒逆转录前后基因组组织结构的比较逆转录病毒逆转录前后基因组组织结构的比较933.5 3.5 病毒基因组复制及表达类型病毒基因组复制及表达类型94DNADNA修复系统修复系统功能功能错配修复错配修复修复错配修复错配碱基和核甘酸切除修复碱基和核甘酸切除修复切除突变的碱基和核甘酸切除突变的碱基和核甘酸DNADNA直接修复直接修复重组修复重组修复易错修复易错修复(SOS(SOS修复修复) )修复嘧啶二体或甲基化修复嘧啶二体或甲基化DNADNA同源单链的置换同源单链的置换超越创伤的复制超越创伤的复制 扼要说明细胞中扼要说明细胞中DNADNA修复系统有哪几种(修复系统有哪几种(8 8分)分) 中国科学院中国科学院20022002年硕士学位研究生入学分子遗传学试题年硕士学位研究生入学分子遗传学试题4 DNA4 DNA的修复的修复95Ø 错配修复错配修复发生于发生于GATCGATC的临近的临近处,故也称为处,故也称为甲基指导的错配甲基指导的错配修复。
修复Ø 参与错配修复的蛋白因子:参与错配修复的蛋白因子:DamDam甲基化酶;甲基化酶;MutHMutH、、MutSMutS、、MutLMutL;;DNADNA解旋酶;解旋酶;SSBSSB;;DNADNA聚聚合酶;核酸外切酶;合酶;核酸外切酶;DNADNA连接酶 错配修复错配修复能使复制的能使复制的保真性提高保真性提高100-1000100-1000倍已在大肠杆菌、酵母和哺已在大肠杆菌、酵母和哺乳动物中发现这一修复系乳动物中发现这一修复系统所有错配都可由这一统所有错配都可由这一系统所修复系统所修复错错配配修修复复工工作作模模型型4.1 4.1 错配修复错配修复96 一些碱基自发脱氨基,然后改变配对性质,一些碱基自发脱氨基,然后改变配对性质,造成氨基转换突变造成氨基转换突变•腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对腺嘌呤变为次黄嘌呤与胞嘧啶配对•鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对鸟嘌呤变为黄嘌呤与胞嘧啶配对•胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对胞嘧啶变为尿嘧啶与腺嘌呤配对Ø 碱基转换突变碱基转换突变Ø DNADNA糖苷消解酶,特异性切除受损糖苷消解酶,特异性切除受损DNADNA上的上的N N-- ß ß-糖苷键,从而形成去除碱基位点(-糖苷键,从而形成去除碱基位点(APAP位点)。
位点)4.2 4.2 切除修复切除修复97Ø 胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶98Ø 胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶胞嘧啶脱氨基生成尿嘧啶, , 在在DNADNA复制时复制时, , 将会产将会产生一个突变生一个突变99Ø 碱基和核苷酸切除修复碱基和核苷酸切除修复1 1))通通过过特特异异的的核核酸酸内内切切酶酶识识别别损损伤伤部部位位并并在在损损伤伤部位的旁边产生切口部位的旁边产生切口2 2))由由核核酸酸外外切切酶酶水水解解包包括括损损伤伤部部位位在在内内的的一一段段DNADNA片段3 3))由由DNADNA聚聚合合酶酶以以母母链链为为模模板板复复制制合合成成一一段段新新子子链链4 4)由)由DNADNA连接酶连接酶封闭切口封闭切口1004.3 DNA4.3 DNA的直接修复的直接修复在在DNADNA光解酶光解酶作用下作用下, ,将环丁烷胸腺嘧啶二将环丁烷胸腺嘧啶二体和体和6-46-4光化物还原光化物还原成为单体成为单体101Ø 直接修复直接修复嘧啶二聚体的酶促光解嘧啶二聚体的酶促光解1024.4 4.4 重组修复重组修复 DNADNA复制时复制时, ,模板单链若有大段损伤模板单链若有大段损伤, ,则新链复则新链复制合成可越过损伤部位而在其下游约制合成可越过损伤部位而在其下游约1000nt1000nt处开处开始。
新链的缺少部分始新链的缺少部分, ,由相应的的同源单链部分通由相应的的同源单链部分通过同源重组而填补然后再通过切除修复过同源重组而填补然后再通过切除修复, ,修复原修复原模板单链的模板单链的损伤部位损伤部位1034.5 4.5 易错修复易错修复(SOS(SOS修复修复) ) 这是一种无模板指导的超越创伤的复制修复,这是一种无模板指导的超越创伤的复制修复,常易错配和致突变常易错配和致突变1045.1 DNA5.1 DNA重组的类型重组的类型5.1.1 DNA5.1.1 DNA重组的含义重组的含义::DNADNA碱基顺序的重新组合碱基顺序的重新组合或或DNADNA片段(或片段(或DNADNA分子)的重新连接分子)的重新连接5.1.2 DNA5.1.2 DNA重组的类型重组的类型::根据对根据对DNADNA序列和蛋白质序列和蛋白质因子的要求不同,可将重组分为因子的要求不同,可将重组分为同源重组和同源重组和非同源重组非同源重组5 DNA5 DNA重组机制重组机制105((1 1)同源重组)同源重组((homologous recombinationhomologous recombination)) 发生于发生于DNADNA的同源序列之间,要求序列相同或的同源序列之间,要求序列相同或相近的较大的相近的较大的DNADNA片段进行交换,通常是两个片段进行交换,通常是两个DNADNA分分子互相交换对等的部分。
如噬菌体的转导、细菌的子互相交换对等的部分如噬菌体的转导、细菌的结合、真核生物非姊妹染色单体之间的交换等结合、真核生物非姊妹染色单体之间的交换等106((2 2)非同源重组:)非同源重组:两个两个DNADNA分子不交换对等的部分分子不交换对等的部分 1 1)转座重组:)转座重组:不需要序列同源性和重组酶不需要序列同源性和重组酶 2 2)位点专一性重组:)位点专一性重组:要求有限的序列同源性,要求有限的序列同源性,即依赖于小范围同源序列的联会如某些噬菌体基即依赖于小范围同源序列的联会如某些噬菌体基因组在宿主基因组上的整合作用因组在宿主基因组上的整合作用5.1.3 5.1.3 研究意义研究意义 重组机制的研究有助于了解基因的结构、功能重组机制的研究有助于了解基因的结构、功能和表达调控机理;有助于进行人类遗传病的基因治和表达调控机理;有助于进行人类遗传病的基因治疗107 5.2 5.2 同源重组同源重组 5.2.1 5.2.1 同源重组的机制同源重组的机制 ((1 1)断裂)断裂——重接假设重接假设 该假设的提出,是基于对真核细胞染色体该假设的提出,是基于对真核细胞染色体减数分裂的细胞学观察。
涉及到双链减数分裂的细胞学观察涉及到双链DNADNA的断裂的断裂和重接染色体收缩所产生的张力导致染色单体和重接染色体收缩所产生的张力导致染色单体断裂,断裂,来自不同染色单体的断裂端按一定顺序交来自不同染色单体的断裂端按一定顺序交互重接互重接;可发生于染色单体的不同区域;最终可;可发生于染色单体的不同区域;最终可产生相互重组的染色单体产生相互重组的染色单体108Ø 断裂断裂—重接假设重接假设109((2 2)单链交换模式)单链交换模式 断裂断裂——重接发生于两个配对的双链重接发生于两个配对的双链DNADNA分子的分子的两条同源单链之间,两个配对的双链两条同源单链之间,两个配对的双链DNADNA分子各自分子各自有一条单链(互为同源单链)断裂,两条同源单有一条单链(互为同源单链)断裂,两条同源单链交叉连接,形成链交叉连接,形成HollidayHolliday结构,交叉点结构,交叉点““分支分支迁移迁移””,在每个双链分子上均形成异源双链区在每个双链分子上均形成异源双链区连接分子的拆分结果,或者形成含有异源双链区连接分子的拆分结果,或者形成含有异源双链区的两条的两条DNADNA分子(新切点位于原来产生断点的两条分子(新切点位于原来产生断点的两条同源单链上),或者形成重组同源单链上),或者形成重组DNADNA分子(新切点位分子(新切点位于原来未产生断点的另外两条同源单链上)。
于原来未产生断点的另外两条同源单链上)110Ø DNADNA单链交换模式单链交换模式111 ((3 3))双链断裂模式双链断裂模式 两条双链两条双链DNADNA分子配对,其中一条分子(受体分子配对,其中一条分子(受体分子)在核酸内切酶的作用下双链断裂,并在核分子)在核酸内切酶的作用下双链断裂,并在核酸外切酶的催化下产生缺口,缺口处的一条单链酸外切酶的催化下产生缺口,缺口处的一条单链3ˊ3ˊ端被另一完整的双链端被另一完整的双链DNADNA分子(供体分子)摄分子(供体分子)摄入其双链区,在该双链区,入侵单链与其互补链入其双链区,在该双链区,入侵单链与其互补链配对,从而使其同源单链的部分区段被取代而形配对,从而使其同源单链的部分区段被取代而形成成D D——环结构入侵单链以其互补链为模板,得以环结构入侵单链以其互补链为模板,得以合成而延伸,同时被置换出的合成而延伸,同时被置换出的D D——环单链不断扩大环单链不断扩大112当当D D——环单链扩至足以填补原受体分子的缺口时,环单链扩至足以填补原受体分子的缺口时,即与缺口处的另一单链的即与缺口处的另一单链的3 3'端退火,并以'端退火,并以D D——环环单链为模板,通过合成而延伸缺口处的单链为模板,通过合成而延伸缺口处的3 3'端单链,'端单链,直至使缺口修复成为完整的双链区。
连接分子拆直至使缺口修复成为完整的双链区连接分子拆分的结果,将产生含异源双链区的分的结果,将产生含异源双链区的DNADNA分子,其中分子,其中有些为重组分子有些为重组分子该工作模式的意义在于该工作模式的意义在于,一条,一条DNADNA分子上的损伤或错误信息,可为其同源分子的分子上的损伤或错误信息,可为其同源分子的对应序列所修复或矫正对应序列所修复或矫正 113Ø 双链断裂启动重组工作模型双链断裂启动重组工作模型1145.2.2 5.2.2 大肠杆菌的大肠杆菌的DNADNA重组重组((1 1)重组酶)重组酶1 1))RecRec A A蛋白:蛋白:是由是由recrec A A基因编码、催化重组基因编码、催化重组基本反应的酶基本反应的酶该酶催化该酶催化DNADNA单链去置换双链中单链去置换双链中的同源链,的同源链,具有:具有:i. i. 单链结合作用;单链结合作用;ii. ii. 依赖于单链的双链解旋作用;依赖于单链的双链解旋作用;iii. iii. 依赖于单链依赖于单链DNADNA的的ATPaseATPase作用;作用;iv. iv. 蛋白酶作用蛋白酶作用1152 2))RecRec BCD BCD酶(核酸外切酶酶(核酸外切酶V V):):其各个亚基分别其各个亚基分别是由是由recrec B B、、recrec C C和和recrec D D基因编码,是一种有效基因编码,是一种有效的的DNADNA降解酶。
具有解旋作用;降解酶具有解旋作用;ATPaseATPase活性;活性;作用作用于双链于双链DNADNA,产生具自由末端的单链区域产生具自由末端的单链区域3 3))RuvRuv A A、、RuvRuv B B和和RuvRuv C C::分别由分别由ruvruv A A、、ruvruv B B和和ruvruv C C编码RuvRuv A A::识别识别HollidayHolliday结构结构RuvRuv B B::是一种是一种ATPATP酶,酶,为为““分支迁移分支迁移””提供力提供力RuvRuv C C::一种核酸内切酶,专一识别一种核酸内切酶,专一识别HollidayHolliday结构结构连接点,连接点,切割连接点以拆分重组中间体切割连接点以拆分重组中间体116((2 2))chichi序列序列: : chichi位点具有恒定的位点具有恒定的8bp8bp不对称序列不对称序列 ,可在大范围内激发重组可在大范围内激发重组 指指E.coliE.coli中由中由RecARecA介导遗传重组的介导遗传重组的““热点热点””序列,是具序列,是具有有较高较高同源重组活性的一段序列,即同源重组活性的一段序列,即GCTGGTGGGCTGGTGG,既是,既是recBCrecBC的的识别序列,又是其激活序列。
识别序列,又是其激活序列 ((3 3)重组反应:)重组反应: RecRec BCD BCD酶使供体双链酶使供体双链DNADNA解旋、切割而产生自解旋、切割而产生自由的末端单链,由的末端单链,RecRec A A蛋白催化该单链侵入受体蛋白催化该单链侵入受体DNADNA的同源区,入侵单链与其互补链退火,置换出其同的同源区,入侵单链与其互补链退火,置换出其同源单链(形成源单链(形成D-D-环),环),RuvRuv A A、、RuvRuv B B使异源双链区使异源双链区形成并扩展(形成并扩展(D-D-环扩大),最后由环扩大),最后由RuvRuv C C将重组中间将重组中间体拆分117Ø 大肠杆菌的大肠杆菌的DNADNA重组机制重组机制1185.3 5.3 位点专一性重组位点专一性重组5.3.1 5.3.1 特点:特点:涉及较短的同源序列;在特定位点上发涉及较短的同源序列;在特定位点上发生断裂和交互重接;是专一的酶促过程生断裂和交互重接;是专一的酶促过程5.3.2 5.3.2 位点专一性重组机制位点专一性重组机制((1 1))λλ噬菌体基因组特点及生活史简介噬菌体基因组特点及生活史简介1 1))λλ噬菌体基因组特点:噬菌体基因组特点:基因组全长基因组全长48kb48kb,,DNADNA双链线双链线形,每个噬菌体颗粒含形,每个噬菌体颗粒含1 1条线形分子条线形分子, , 具有具有1212核苷酸的核苷酸的5ˊ-5ˊ-端单链突起(这些互补顺序,在感染端单链突起(这些互补顺序,在感染E. coliE. coli之后,之后,立即退火,以形成环状分子)。
立即退火,以形成环状分子)1192)2)λλ噬菌体生活史噬菌体生活史1203 3))λλ噬菌体的位点专一性重组机制噬菌体的位点专一性重组机制 λλ整合酶整合酶IntInt和整合宿主因子和整合宿主因子IHFIHF结合于结合于attPattP,形成复合,形成复合物(整合体),然后再识别并结合于物(整合体),然后再识别并结合于attBattB,在,在IntInt的催化下,的催化下,attPattP和和attBattB核心区核心区DNADNA双链序列分别断裂,所产生的互补单链双链序列分别断裂,所产生的互补单链末端再进行交叉杂交和连接,从而使末端再进行交叉杂交和连接,从而使λDNAλDNA整合进入整合进入E. coliE. coli染色体染色体DNADNA中4 4)切除反应)切除反应 通过控制通过控制IntInt和和XisXis蛋白的量而在蛋白的量而在attLattL和和attRattR处切割此处切割此种切割又分为精确切割与不精确切割种切割又分为精确切割与不精确切割 1211221235.4 5.4 转座重组转座重组5.4.1 5.4.1 转座(因)子转座(因)子((transposibletransposible element element):):能够在不同能够在不同DNADNA间转移位置的间转移位置的DNADNA序列,是一类普遍序列,是一类普遍存在于各类生物中的遗传因子。
存在于各类生物中的遗传因子5.4.2 5.4.2 转座(因)子类型转座(因)子类型简单转座子(插入序列简单转座子(插入序列insertion sequenceinsertion sequence,,ISIS))复合转座子(复合转座子(transposontransposon,,TnTn)) 124插入序列(插入序列(IS))是最简单的转座子,是细菌染色体和质粒是最简单的转座子,是细菌染色体和质粒的正常组分,是一个自主的单位的正常组分,是一个自主的单位IS元件具有转座酶基因,元件具有转座酶基因,其末端具有其末端具有20~40bp的反向重复序列(的反向重复序列(inverted repetitive sequence,,IR),通常用),通常用IS再加上再加上鉴定定类型的型的编号来表示号来表示125复合转座子复合转座子除含有转座酶基因外,还含有其它基除含有转座酶基因外,还含有其它基因(如抗药基因),这就赋予宿主细胞一定的表因(如抗药基因),这就赋予宿主细胞一定的表型有些转座子的重复顺序就是型有些转座子的重复顺序就是ISIS1265.4.3 5.4.3 转座子的结构特征转座子的结构特征 大小大小 基因种类基因种类 ISIS与与TnTn之间的关系之间的关系IS 0.7 - 1.8kb IS 0.7 - 1.8kb 转座酶基因转座酶基因 TnTn 4.5 - 20kb 4.5 - 20kb 转座基因、抗性基因转座基因、抗性基因 某些某些ISIS参与参与TnTn的构成的构成 1275.4.4 5.4.4 转座机制转座机制1 1)分类)分类非复制型转座:非复制型转座:直接从供体位点转移到受体位点直接从供体位点转移到受体位点, , 供体上留下缺口。
供体上留下缺口 复制型转座:复制型转座:先复制先复制, , 后转移,供体不变后转移,供体不变1282 2))转座机制转座机制 转座酶能够识别和切割供体分子的特异性末端转座酶能够识别和切割供体分子的特异性末端, , 在在转座开始时转座开始时, , 在转座子两端切开在转座子两端切开DNADNA双链中的每一条链双链中的每一条链转座酶同样能识别靶点转座酶同样能识别靶点DNADNA序列,并在该序列两侧交错切序列,并在该序列两侧交错切割,产生两个游离单链末端转座子插入上述切口之间,割,产生两个游离单链末端转座子插入上述切口之间,并与两个受体单链末端共价连接;由此形成的两段靶点并与两个受体单链末端共价连接;由此形成的两段靶点序列单链区则由序列单链区则由DNADNA聚合酶或其它具有类似酶活性的酶催聚合酶或其它具有类似酶活性的酶催化而得到填补,最后由连接酶将断口封闭这样就导致化而得到填补,最后由连接酶将断口封闭这样就导致了部分靶点序列的加倍上述反应既无转座子和靶序列了部分靶点序列的加倍上述反应既无转座子和靶序列之间碱基配对的发生,也不需要二者之间序列同源性的之间碱基配对的发生,也不需要二者之间序列同源性的存在。
存在129Ø 转座机制及靶点同向重复序列的产生转座机制及靶点同向重复序列的产生130Ø 复制型转座复制型转座——转座作用的一种模型转座作用的一种模型1315.4.5 5.4.5 转座子的某些遗传学效应转座子的某些遗传学效应((1 1)引起插入突变)引起插入突变 ((2 2)插入位置上出现新的基因)插入位置上出现新的基因((3 3)靶)靶DNADNA上少数碱基对的重复上少数碱基对的重复((4 4)靶染色体畸变)靶染色体畸变((5 5)切除反应导致回复突变)切除反应导致回复突变1325.4.6 5.4.6 逆转录转座子逆转录转座子((1 1)逆转录病毒的基因组特点)逆转录病毒的基因组特点 逆转录病毒为正链逆转录病毒为正链RNA病毒,其病毒,其基因组含基因组含2 2分子单链分子单链RNARNA,,2 2分子分子tRNAtRNA,为二倍体病毒为二倍体病毒基因基因gaggag,编码核心蛋白;,编码核心蛋白;polpol,编码逆转录酶和整合酶,编码逆转录酶和整合酶等;等;envenv,编码被膜蛋白编码被膜蛋白 逆转录病毒的基因组结构逆转录病毒的基因组结构133(2)(2)整合机制整合机制134。
