sds-page电泳操作规范.doc

聚丙烯酰氨凝胶电泳一 简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）二 作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关三 电泳过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量， 因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。

因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的四 操作步骤所需试剂及仪器： 试剂：丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker5只（50ul装），小牛血清白蛋白10mg仪器设备：电泳仪、槽、板5套；10ml小烧杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量滤纸，0.45μm滤器。

母液：1、2M Tris-HCL (pH8.8)100ml：24.2g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml高压灭菌处理2、1M Tris-HCL (pH6.8)100ml：12.1g Tris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml高压灭菌处理3、10%SDS100ml：10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml4、50%（w/v）甘油 100ml：50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可5、1%（w/v）溴酚兰（染色）10ml：100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml6、0.01mol/L乙酸钠溶液100ml：0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.27、1M DTT20ml：20ml0.01mol/L乙酸钠溶液溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml/份，-20℃保存工作液：1、30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml100ml： 丙烯酰胺29g，双丙烯酰胺1g，去离子水在37℃溶解，定容到100ml0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存pH≤7.02、4×分离胶缓冲液（B液）100ml：                  75ml 2M Tris-HCL (pH8.8)                          4ml 10%SDS                          21ml蒸馏水                          4℃存放。

3、4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml：                   50ml 1M Tris-HCL (pH6.8)                          4ml 10%SDS                          46ml蒸馏水                          4℃存放4、10%过硫酸铵（D液）5ml：                 0.5g过硫酸铵，5ml蒸馏水，0.1m分装5、TEMED （E液）5、1×Tris-甘氨酸缓冲液1L：Tris-base 3g                          甘氨酸 14.4g                          SDS 1g蒸馏水定容到1L，pH8.3左右6、5×上样缓冲液 10ml：                 0.5ml 1M Tris-HCL（pH6.8）                       1ml 1M DTT                       2ml 10% SDS                       1ml 1%溴酚兰                       5ml 50%甘油                       0.5ml 蒸馏水7、考马斯亮蓝染色液 1L：                   考马斯亮蓝R-250 1.0g                       甲醇450ml                       冰醋酸 100ml                       蒸馏水450ml8、考马斯亮蓝脱色液 1L：                   甲醇100ml                       冰醋酸 100ml                       蒸馏水800ml步骤：一、组装模具：用海绵蘸取少量清洁剂，擦洗干净两块玻璃板，自来水冲洗3—5遍然后，再用无水乙醇冲洗2遍，晾干待用。

将已清洗干净的两块玻璃板用封条封严组装在电泳架上，浅玻璃板朝外（靠近操作者一侧），然后固定结实注意：清洗玻璃板时动作要轻柔，切勿划破玻璃面；清洗干净之后，不要用手碰玻璃面二、制胶：1、  配10%分离胶10ml：吸取A液3.3ml，B液2.5ml，蒸馏水4.2ml，D液100μl，在小烧杯中摇匀，再加入E液10μl，立即混匀并用10ml注射器吸取大约8ml混合溶液，沿着玻璃板之间缝隙左上处，缓慢灌胶，一直到距前玻璃板上沿1.5cm处为止注意：A当凝胶完全浸没玻璃板底的时候，留意观察是否漏胶若漏胶，则立即停止灌胶，重新固定模具之后再继续B灌胶应缓慢进行，避免有气泡产生）2、  水膜封闭空气：在分离胶上面小心加入一层蒸馏水，以隔绝空气，促进凝胶聚合等待约20—30min，交界面有明显的折光线，且倾斜模具，交界面不随之改变，为凝胶凝固良好用滤纸小心洗干水分3、  配5%浓缩胶5ml：吸取A液0.67ml，C液1.0ml，蒸馏水2.3ml，D液50μl，在小烧杯中摇匀，再加入E液5μl，立即混匀，灌胶，到到前玻璃板上沿即可4、  插上齿梳，确保无气泡等待凝胶完全聚合，约需30分钟5、  小心拔出梳子，卸下封条，将玻璃板颠倒放置，使浅玻璃板朝内，固定在电泳架上。

将整个电泳架放入电泳槽，在内外槽中倒入电泳缓冲液，内槽液面应在前后玻璃板之间三、点样：1、  吸取20μl蛋白样品到EP管中，加入4μl上样缓冲液，混匀，沸水中加热5min2、  全部样品上样，小心不要使样品漂散3、  同时吸取蛋白Marker10—20μl点样四、  电泳：连接好正负极导线，稳压120V，至溴酚兰到达分离胶底部五、染色：1、  剥胶2、  将凝胶小心放入考马斯亮蓝染液浸泡，45℃摇床摇30min3、  脱色：将凝胶浸泡入考马斯亮蓝脱色液中，放入一小块海绵，45℃摇床摇4—8h，其间更换脱色液3—4次，观察蛋白电泳情况参考资料：牛血清白蛋白分子量： 6.6KD因此，分离胶浓度选为10%。