06第六章凝胶过滤ppt课件.ppt

第六章第六章 凝胶过滤凝胶过滤n凝胶过滤〔又叫分筛层析〕是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法n其原理是：n 凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物却被排阻在外部;n 当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子质量筛分开了n凝胶过滤特点：设备简单、操作方便、重复性好和样品回收率高等 n常用于：n 分离纯化蛋白质(包括酶类)、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物；n还可用于:n 测定蛋白质的分子质量，样品的浓缩和脱盐等方面第一节第一节 凝胶的分类及性质凝胶的分类及性质 n凝胶是不溶于水但在水中有较大膨胀度和较好分子筛功能的一类化合物n这化合物目前主要有：n                              葡聚糖凝胶n                              天然琼脂糖n                              交联琼脂糖n其次还有：n            聚丙烯酰胺凝胶(生物胶Bio-gel)n            交联葡聚糖与双丙烯酰胺共聚凝胶  n            交联琼脂糖与葡聚糖共结合的凝胶 (superdex)    n            详见表6-1。

 一、葡聚糖凝胶一、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶的商品名称为葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex它它是是由由葡葡聚聚糖糖[右右旋旋糖糖酐酐(G型型)]和和3-氯氯-1,2环环氧氧丙丙烷烷(交联剂交联剂)以醚键相互交联而成的以醚键相互交联而成的其结构式如图其结构式如图6-1所示在在交交联联葡葡聚聚糖糖G-25和和G-50中中分分别别加加入入羟羟丙丙基基基基团团反应，即可构成反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶型烷基化葡聚糖凝胶 1．理化性质．理化性质葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒葡聚糖凝胶的外观为白色珠状颗粒它它带带有有大大量量的的羟羟基基，，亲亲水水性性好好，，因因此此在在水水溶溶液液或或电解质溶液中极易膨胀电解质溶液中极易膨胀由由于于各各种种型型号号的的葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶的的交交联联度度不不同同，，致致使使如下理化性质在水中的有明显的差异：如下理化性质在水中的有明显的差异： 膨胀度膨胀度(床体积床体积) 吸吸水水量量(每每克克干干凝凝胶胶在在水水中中充充分分膨膨胀胀时时所所需需的的水量水量) 筛孔的大小筛孔的大小 分级范围分级范围 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶的的型型号号不不同同，，其其性性质质亦亦不不一一样样，，详详见见表表6-2。

n以G型葡聚糖凝胶(经水溶液膨胀)作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析n以LH型葡聚糖凝胶(经乙醇或二甲亚砜甲酰胺或N、N-二甲基甲酰胺等有机溶剂膨胀)作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析 2．稳定性．稳定性 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶在在水水溶溶液液、、盐盐溶溶液液、、碱碱溶溶液液、、弱弱酸酸溶溶液液和和有有机机溶溶剂剂中中是是稳稳定定的的、、不不溶溶解解的的，，而而且且很很少产生化学降解少产生化学降解在在中中性性条条件件下下，，葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶悬悬浮浮液液可可置置高高温温(120℃℃)消毒消毒0.5h，其性质并不改变其性质并不改变在在0.1mol／／L HCl溶溶液液中中浸浸泡泡1~2h，，甚甚至至在在0.02mol／／L HCI溶溶液液中中浸浸泡泡6个个月月以以上上，，对对分分离效果无明显的影响离效果无明显的影响当当暴暴露露于于强强酸酸或或氧氧化化剂剂溶溶液液时时，，则则容容易易使使糖糖苷苷键键水解断裂，因此，要避免与其接触水解断裂，因此，要避免与其接触葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶欲欲在在室室温温下下长长期期保保存存时时，，应应加加入入适适量量的的防防腐腐剂剂如如氯氯仿仿、、0.05％％NaN3或或20％％乙乙醇醇等等，，不然微生物将生长。

不然微生物将生长 3．吸附性．吸附性 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶系系弱弱酸酸性性物物质质，，这这是是由由于于其其每每克克干干胶胶中中含含10~20μg当当量量的的羧羧基基基基团团所所致羧羧基基基基团团能能与与分分离离物物中中电电荷荷基基团团 (尤尤其其是是碱性蛋白质碱性蛋白质)发生吸附作用发生吸附作用这这种种吸吸附附作作用用可可以以借借助助提提高高洗洗脱脱液液的的离离子子强度得以克服强度得以克服 当当离离子子强强度度大大于于0.05时时，，一一般般对对弱弱碱碱性性蛋白质就无吸附力了蛋白质就无吸附力了 因此，常用含有因此，常用含有NaCl的缓冲液作洗脱液的缓冲液作洗脱液 n新购得葡聚糖凝胶对蛋白质往往有不可逆的吸附性能，需先用易得到的蛋白质进行预层析，以便消除其影响(虽然吸附的数量较少，但是在制作测定蛋白质分子质量的标准曲线时，或者分离纯化极难得到的物质时,需预层析) n此外；葡聚糖凝胶对芳香族化合物或杂环化合物以及某些凝集素具有较强的吸附作用，n    若采用凝胶过滤层析分离它们时，往往利用的是吸附性能，而不是排阻原理  二、琼脂糖凝胶二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离出来的。

琼脂糖是从琼脂中分离出来的在在制制备备过过程程要要将将其其中中含含硫硫酸酸根根和和羧羧基基基基团团的的琼琼脂脂胶胶除除去去，，得得到到不不带带电电荷荷基基团团的的琼琼脂糖琼琼脂脂糖糖是是由由D-半半乳乳糖糖和和3、、6脱脱水水的的L-半半乳乳糖连接构成的多糖链糖连接构成的多糖链这这种种多多糖糖链链在在100℃左左右右时时呈呈液液态态，，当当温温度度下降到下降到45℃以下时呈固态以下时呈固态它它们们之之间间以以氢氢键键方方式式相相互互连连接接就就成成了了线线性性的的双双链链单单环环的的琼琼脂脂糖糖，，经经凝凝聚聚即即呈呈束束状状的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶 n该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在pH4.0~9.0的缓冲液中是稳定的n琼脂糖凝胶室温保存，其物理稳定性超过了聚丙烯酰胺和葡聚糖凝胶n琼脂糖凝胶在干燥状态下保存时易破裂，故一般存放在含防腐剂的水溶液中，同时还要避免剧烈的搅动n琼脂糖凝胶按其浓度来分有Sepharose 2B(2％)、4B(4％)和6B(6％)n     Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B nSepharose与1，3-二溴异丙醇(1，3-dibromopropano1)在强碱性条件下反应后，即生成CL-型交联琼脂糖。

n这种琼脂糖的筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，但热稳定性和化学稳定性都有了提高nCL-型交联琼脂糖可在广范围的pH溶液(pH3~14)中使用，即使用较强的碱溶液短时间处理，其性能也不会改变，n但是，在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚n琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好正如前章所述，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些n琼脂糖凝胶的有关性质见表6-1和表6-3  三、聚丙烯酰胺凝胶三、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为聚丙烯酰胺凝胶的商品名称为Bio-gel它它是是以以甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺(双双体体)作作交交联联剂剂，，以以过过硫酸铵作催化剂，硫酸铵作催化剂， 在在N,N,N’,N’,- 四四甲甲基基乙乙二二胺胺(TEMED)加加速速剂剂的的作用下，作用下， 将丙烯酰胺将丙烯酰胺(单体单体)聚合而成的聚合而成的当当改改变变单单体体浓浓度度时时，，就就可可得得到到吸吸水水率率不不同同的的产产物 n商品聚丙烯酰胺凝胶型号有Bio-gel P-2到P-300，其阿拉伯数字相当于排阻限度的10-3n一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，并以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。

n该凝胶不溶于水和普通有机溶剂，能忍受浓的盐、尿素和胍盐等溶液的浸泡；n在pH1~10或短时间超过此pH范围的溶液中较稳定，要避免长期与强酸和强碱接触 n聚丙烯酰胺凝胶对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，如使用离子强度略高的洗脱液操作，此弊病可以克服n聚丙烯酰胺凝胶的物理性质见表6-4  四、四、SephacrylSephacryl是是由由烯烯丙丙烷烷基基葡葡聚聚糖糖与与甲甲撑撑双双丙丙烯烯酰酰胺胺共价交联制成的共价交联制成的属硬性凝胶，具有筛孔和少量的羧基基团属硬性凝胶，具有筛孔和少量的羧基基团Sephacryl吸吸水水时时，，其其珠珠状状颗颗粒粒直直径径为为25-75um(见见表表6-5)通常是用于水相系统中通常是用于水相系统中若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化若在有机相系统使用时，其孔径大小略有变化 n它在所有的溶剂中不溶解，化学降解也很少；n它可在pH2~11范围内使用，当pH低时，葡聚糖链将发生少许水解作用；n在0.2mol／L NaOH溶液中(室温)处理100h，对其低流速和多孔性没有明显影响n用去污剂(如SDS)、6mol／L盐酸胍和8mol／L尿素溶液可作为洗脱剂，n高温(120℃)消毒(pH7.0时)处理后，层析性质没有明显变化。

 nSephacryl能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖(proteoglycans)， 甚 至 大 的 病 毒 颗 粒 (直 径 >300-400nm)也可用它分离n层析时，用细颗粒凝胶分辨率高 五、五、SuperdexSuperdex是是由由高高交交联联度度多多孔孔琼琼脂脂糖糖与与葡葡聚聚糖糖共共价价结合而成的结合而成的该该凝凝胶胶具具有有良良好好的的分分子子筛筛特特性性和和物物理理、、化化学学稳稳定定性在在用用其其分分离离样样品品过过程程中中，，溶溶液液的的酸酸碱碱度度可可在在pH3~12范范围围内内变变化化，，溶溶液液中中加加入入去去污污剂剂(如如1％％SDS)和和(或或)解解离离剂剂(如如8mol／／L尿尿素素、、6mol／／L盐酸胍盐酸胍)时，也不会影响分离效果时，也不会影响分离效果此凝胶共有此凝胶共有6种类型，详见表种类型，详见表6-6n除上述5类凝胶外，还有：n           Superose(高交联度的多孔琼脂糖珠，有制备级和分析级)、n           玻璃珠n           聚苯乙烯凝胶n           等也具有分子筛功能n玻璃珠n    有大量的网孔，且分布均一;n    它机械性能良好，在较高的层析流速下，分辨率并不受影响;n     缺点是对蛋白质等物质有吸附能力。

  第二节  基本原理n凝胶过滤层析的基质凝胶过滤层析的基质:n 具具有有立立体体网网状状结结构构、、筛筛孔孔直直径径一一致致，，且且呈呈珠珠状状颗颗粒粒的物质n排阻、扩散效应〔见下图）排阻、扩散效应〔见下图）n 这这种种基基质质可可以以完完全全或或者者部部分分排排阻阻某某些些大大分分子子化化合合物物于筛孔之外，于筛孔之外，n 而而不不能能排排阻阻某某些些小小分分子子化化合合物物，，但但可可让让其其在在筛筛孔孔中中自由地扩散、浸透自由地扩散、浸透 n 任任何何一一种种被被分分离离的的化化合合物物在在凝凝胶胶层层析析柱柱被被排排阻阻的的范范围均在围均在0~100％之间 n分配系数分配系数Kavn 用用分分配配系系数数Kav表表示示被被排排阻阻的的程程度度；；即即：：分分离化合物分配在内水和外水体积中的比例关系离化合物分配在内水和外水体积中的比例关系n Kav值值的的大大小小依依赖赖于于凝凝胶胶床床的的总总体体积积(Vt)、、外外水水体体积积(V0)以以及及分分离离物物本本身身的的洗洗脱脱体体积积(Ve)即即: n Kav=（（Ve-Vo））/（（Vt-Vo））n在限定的层析条件下，在限定的层析条件下，n Vt和和Vo都为恒定值，都为恒定值，n Ve值是随着分离物分子质量的变化而变化的。

值是随着分离物分子质量的变化而变化的 n 分离物分子质量大，分离物分子质量大，Kav值小；值小；n 反之，反之，Kav值增大 n分离过程分离过程n 在同一凝胶过滤柱上分子质量不同的混合物在同一凝胶过滤柱上分子质量不同的混合物质，由于流动相的作用，这些物质将发生排阻质，由于流动相的作用，这些物质将发生排阻和扩散效应和扩散效应 n 若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和若缓冲液连续倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续发生；扩散效应也将连续发生；n 结果是分子质量大的物质先从柱中流出，结果是分子质量大的物质先从柱中流出，n 分子质量小的物质则后从柱中流出分子质量小的物质则后从柱中流出n ( (见图见图6-2) 6-2) n 流出物分管等量或等时地收集，流出物分管等量或等时地收集，n 检测后分段合并相同组分的各管流出物，把检测后分段合并相同组分的各管流出物，把分子质量不同的物质相互筛分开了分子质量不同的物质相互筛分开了n筛分效果筛分效果n 受操作条件的影响受操作条件的影响( (如基质的颗粒大小、均如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等速以及样品的种类等) )；；n 更为直接的影响是更为直接的影响是KavKav值的差异性。

值的差异性 n Kav Kav值差异性大，分离效果好；值差异性大，分离效果好；n Kav Kav值差异性小，乃至等于值差异性小，乃至等于1 1或等于零或等于零( (即即使样品中各组分的分子质量相差很大使样品中各组分的分子质量相差很大) )，则分，则分离效果很差，或根本不能分开离效果很差，或根本不能分开nKav值的计算值的计算n 从公式从公式Kav=（（Ve-Vo））/（（Vt-Vo〕看出，〕看出，n 只要测出：床体积只要测出：床体积Vtn 外水体积外水体积Von 洗脱体积洗脱体积Ven 即可计算出即可计算出Kav值l凝胶床总体积Vt的求得l 有如下2种方法可求得Vt l I.计算法l 根据层析柱体积计算总体积，可用下列公式表示l Vt =πr2hl 式中, r为层析柱半径；l h为凝胶床高度；l π为圆周率。

II.测量法知，床体积Vt               Vt=Vo+Vi+Vg因Vg与Vt相比是很小的，可忽略不计，故                Vt=Vo+Vi Vo和Vi可以通过实验测得(见图6-3)，如下：  通过实验求Vo和Vi 当把分子质量不同的混合溶液铺在凝胶床上时， 溶液中的分子大于凝胶孔径上限者，不能进入凝胶网孔内，而被排阻在外水体积的溶液中 凝胶床的洗脱体积Ve刚好等于外水体积Vo， 即: Ve=Vo (Kav=0) 溶液中的分子小于凝胶孔径下限者，能自由进入凝胶网孔内； 凝胶床的洗脱体积Ve应等于凝胶床总体积, 即: Ve=Vt=Vo+Vi (Kav=1) 那么: Vi=Ve-Vo 溶液中的分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者，则有一部分能进入凝胶网孔，故其洗脱体积 Ve是在Vo和Vt之间(Kav在0～1之间)      实践中     测定外水体积〔Vo）  通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质        理由是：        该物质分子质量大(为200万)，呈蓝色，        在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，           并可借助本身的颜色，采用肉眼或分光光度计检测(在210nm或260nm、620nm)洗脱体积Ve，即                         Ve = Vo           测定内水体积(Vi)      可选用硫酸铵、N—乙酰酪氨酸乙酯，或者其他与凝胶无吸附力的小分子物质。

即：                        Vi = Ve - Vo洗脱体积Ve     分子大小介于凝胶孔径上限和下限之间者的洗脱体积Ve也是通过实验测得     故可求得某一分离物的Kav值=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）        分离物在凝胶过滤层析时的行为，除用Kav和Kd表示外，还可用Ve／Vo或Vo／Ve(R值)表示这些值的大小见图6-3 第三节  操    作  一、凝胶的选择和处理一、凝胶的选择和处理 1．凝胶的选择．凝胶的选择(1)型号型号 凝胶型号多型号不同，筛分范围亦不相同凝胶型号多型号不同，筛分范围亦不相同 Sephadex G型一般适宜于分离蛋白质型一般适宜于分离蛋白质蛋白质脱盐时，可选用凝胶蛋白质脱盐时，可选用凝胶SephadexG-25 一般来说，一般来说， 在在规规定定的的筛筛分分范范围围内内，，混混合合物物之之间间分分子子质质量量差差别越大，分离的效果越好别越大，分离的效果越好 n(2)(2)粒度粒度 n凝胶的粒度有粗有细凝胶的粒度有粗有细( (与交联度无关与交联度无关) )n细细颗颗粒粒凝凝胶胶之之间间空空间间小小，，装装柱柱易易均均一一，，因因此此分分离离效效果果较粗得好较粗得好 ( (见图见图6-4)6-4)。

n 但但细细颗颗粒粒凝凝胶胶流流速速慢慢，，故故宜宜用用大大直直径径的的层层析析柱柱，，这这类凝胶用于小型试验，可得到满意结果类凝胶用于小型试验，可得到满意结果n 粗粗颗颗粒粒凝凝胶胶流流速速快快，，宜宜用用于于小小直直径径的的层层析析柱柱，，如如操操作得当也可得到较满意的结果作得当也可得到较满意的结果  2．凝胶用量的计算．凝胶用量的计算根根据据层层析析柱柱的的体体积积和和干干凝凝胶胶的的膨膨胀胀度度(见见表表6-2)，，按按下下面面的公式可计算出所需干凝胶的用量：的公式可计算出所需干凝胶的用量： 干凝胶用量〔干凝胶用量〔g））=πr2h / 膨胀度膨胀度 膨胀度膨胀度=床体积床体积/g用用此此法法计计算算出出的的干干凝凝胶胶用用量量还还需需增增加加10％％~20％％，，因因为为凝胶在处理过程中会有一部分损失凝胶在处理过程中会有一部分损失  3．凝胶的处理．凝胶的处理将将所所用用的的干干凝凝胶胶慢慢慢慢倾倾人人5~10倍倍的的蒸蒸馏馏水水中中，，（（参参照照表表6-2凝胶溶胀所需的时间〕进行充分浸泡凝胶溶胀所需的时间〕进行充分浸泡然后用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒然后用倾斜法除去表面悬浮的小颗粒 再再用用0.5mol／／L NaOH-0.5mol／／L NaCl溶溶液液在在室室温温下下浸浸泡泡0.5h以抽滤法除去碱液以抽滤法除去碱液 用蒸馏水洗至中性用蒸馏水洗至中性 。

n注n为了除去凝胶颗粒空隙中的气泡：n可把处理过的凝胶浸泡于蒸馏水或平衡液中用抽气方法实现n有时采用加热煮沸方法，不仅能达到此目的，而且还能加快凝胶的溶胀速度n但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热  二、凝胶柱的制备二、凝胶柱的制备 1．柱的选择．柱的选择当当用用同同样样直直径径的的层层析析柱柱分分离离两两种种以以上上的的物物质质时时，，长长层层析析柱柱比比短短的的分分辨辨率率高高(见见图图6-5Ⅱ、、Ⅲ)；；当当用用同同样样长长度度的的层层析析柱柱分分离离两两种种以以上上的的物物质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；质时，层析柱直径大的比小的分辨率高；当当用用同同样样体体积积的的层层析析柱柱分分离离两两种种以以上上的的物物质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高质时，仍是层析柱长的比短的分辨率高一般理想的层析柱之直径与长度之比是一般理想的层析柱之直径与长度之比是 1：：25 ~ 1：：100 2．装柱．装柱装装柱柱的的具具体体操操作作与与要要求求按按第第三三章章吸吸附附柱柱层层析析的的装装柱方法进行柱方法进行 3．凝胶柱的鉴定．凝胶柱的鉴定 新新装装的的凝凝胶胶柱柱用用适适当当缓缓冲冲液液平平衡衡后后，，将将带带色色的的蓝蓝色色葡葡聚聚糖糖-2000、、或或者者红红色色葡葡聚聚糖糖、、细细胞胞色色素素C、、血血红红蛋蛋白白等等物物质质配配成成2mg／／ml的的溶溶液液过过柱，观察色带是否均匀下降。

柱，观察色带是否均匀下降 如如均均匀匀下下降降，，则则表表明明柱柱中中凝凝胶胶是是均均匀匀的的，，或或者者说说柱柱中中没没有有裂裂缝缝和和气气泡泡，，是是可可以以使使用用的的，，否则就须重新装柱否则就须重新装柱 如如果果凝凝胶胶柱柱鉴鉴定定时时用用的的是是蛋蛋白白质质类类物物质质进进行行，，除除能能起起到到鉴鉴定定柱柱子子的的作作用用外外，，还还可可起起到到克克服某些分离物被不可逆吸附的作用服某些分离物被不可逆吸附的作用  三、加样与洗脱三、加样与洗脱 1．加样．加样 加样量与测定方法和层析柱大小有关加样量与测定方法和层析柱大小有关 如如测测定定样样品品含含量量的的方方法法灵灵敏敏或或床床体体积积小小时时，，加加样量可少，否则反之样量可少，否则反之 例如：例如： 一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法：一般测定蛋白质的含量多用紫外分光光度法： 当当采采用用280nm观观察察消消光光读读数数时时，，加加样样量量需需5mg左右左右(柱体积柱体积2cm×60cm)；； 当当采采用用220nm观观察察消消光光读读数数时时，，加加样样量量只只需需1.2mg左右。

左右 n 一般来说，n 加样量越少，n 或加样体积越小(样品浓度高时)，n 分辨率越高 n 加样体积多少为宜?n 要视被分离物在层析柱的分配系数(Kav)或洗脱体积(Ve)来决定 n假设：n       A、B两个被分离物在层析柱中分离，n       洗脱体积分别为VeA、VeB，n       分配系数分别为Kav’、Kav”n       n        A、B两物洗脱体积之差称为分离体积，以Vs表示n        则Vs=VeA-VeBn    当，样品体积(Vp) = Vs时，n         理论上的洗脱图形是两种物质恰好分开n        n         实际情况并非如此，n         由于样品流过柱时的扩散作用，其体积会逐渐增大，致使其洗脱体积远比原来大n        n        因此，n        当Vp ≥ Vs时，n        A、B两种物质就不能完全分开(见图6-6Ⅱ)；n        当Vp＜Vs时，n        A、B两种物质就能分开(见图6-6I)n求Vs n     根据Kav = （Ve-Vo）/ （Vt-Vo）n          则Ve  =  Vo+Kav〔Vt-Vo）n          则Vs  =  VeA-VeBn                              =（Kav’-Kav”）（Vt-Vo）n     即，分离效果是与加样体积、被分离样品在层析柱中的洗脱体积或分配系数，以及凝胶床体积有关。

n    所以，为了提高分离效果，在一定范围内，加样体积越小越好n    此外，样品的黏度也影响层析的分辨率n    一般使用的样品黏度以小于2，或者与洗脱液的黏度相当为宜 2．洗脱．洗脱洗脱液选择洗脱液选择 能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则能溶解被洗脱物质和不使其变性或失活为原则 一一般般地地，，都都以以单单一一缓缓冲冲液液(如如磷磷酸酸缓缓冲冲液液、、Tris·HCl缓缓冲冲液液等等),或或者者盐盐溶溶液液作作为为洗洗脱脱液液，，有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液有时甚至也可以用蒸馏水作洗脱液流速流速 洗洗脱脱时时的的流流速速要要严严格格控控制制，，否否则则收收集集的的每每一一部部分分洗洗脱脱体体积积就就不不会会恒恒定定，，理理想想的的分分配配系系数数就就难难以测出 控控制制流流速速的的最最好好装装置置是是恒恒流流泵泵(微微量量泵泵)，，它它不不仅仅可可以以使使流流速速恒恒定定，，而而且且还还可可以以使使其其在在较较大大范围内选择范围内选择 若无此装置，可用控制操作压的办法进行若无此装置，可用控制操作压的办法进行n3.搜集搜集n 分管收集洗脱液。

分管收集洗脱液n4.测定测定n 选用适当的方法进行定性和定量测定选用适当的方法进行定性和定量测定  四、凝胶柱的再生及保存四、凝胶柱的再生及保存 1．再生．再生仅仅使使用用过过一一次次的的凝凝胶胶柱柱，，通通常常进进行行重重新新平平衡衡后后即即可再次使用；可再次使用； 使使用用过过多多次次后后，，由由于于凝凝胶胶床床体体积积变变小小、、流流动动速速度度降降低低或或污污染染杂杂质质过过多多等等原原因因，，致致使使其其正正常常性性能受到影响须进行再生处理能受到影响须进行再生处理方方法法是是，，先先用用水水反反复复进进行行逆逆向向冲冲洗洗，，再再用用缓缓冲冲液液进行平衡平衡毕，即可重复使用；进行平衡平衡毕，即可重复使用；另另一一种种方方法法是是，，把把凝凝胶胶倒倒出出，，用用低低浓浓度度的的酸酸或或碱碱按按其其预预处处理理方方法法进进行行，，处处理理后后重重新新装装柱柱即即可可再再行使用行使用  2．保管．保管若若要要短短时时间间保保存存，，则则需需进进行行反反复复洗洗涤涤除除去去蛋蛋白白质质等等杂杂质质，，并加入适当的防霉剂并加入适当的防霉剂(见表见表6-8)；；若若要要长长时时间间保保存存，，则则需需将将凝凝胶胶从从柱柱中中取取出出，，进进行行洗洗涤涤、、脱水和干燥。

脱水和干燥 其方法如下：其方法如下： 洗涤洗涤 将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后，将凝胶用低浓度的酸或碱溶液短时间浸泡后， 再用水反复洗涤除去杂质、过滤抽干再用水反复洗涤除去杂质、过滤抽干 脱水脱水 浸泡在浸泡在50％乙醇溶液中进行脱水％乙醇溶液中进行脱水 然后，再过滤抽干；然后，再过滤抽干； 并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中并浸泡在浓度稍高的乙醇溶液中 如此依次提高乙醇浓度进行反复处理，如此依次提高乙醇浓度进行反复处理， 待乙醇浓度增加至待乙醇浓度增加至95％时，将凝胶抽干；％时，将凝胶抽干； 枯燥枯燥 置置60、烘箱中烘干，可装瓶保存烘箱中烘干，可装瓶保存 第四节第四节 应应 用用 一、脱盐和浓缩一、脱盐和浓缩利利用用盐盐类类小小分分子子物物质质可可以以进进入入凝凝胶胶筛筛孔孔中中，，而而大大分分子子物物质质则则被被排排阻阻在在其其外外的的原原理理，，可可进进行行蛋蛋白白质等溶液的脱盐。

质等溶液的脱盐该该法法脱脱盐盐的的速速度度不不仅仅比比透透析析快快，，而而且且不不会会引引起起大大分子物质变性分子物质变性此此外外，，利利用用凝凝胶胶的的吸吸水水性性能能，，对对生生命命大大分分子子溶溶液液进行浓缩也是很有效的进行浓缩也是很有效的一一般般用用于于这这些些操操作作的的材材料料是是细细颗颗粒粒葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶G-25  二、分离生命物质二、分离生命物质对对于于某某些些理理化化性性质质相相似似(如如溶溶解解度度、、带带电电性性质质)而而分分子子质质量量不不同同，，或或者者是是聚聚合合体体不不等等的的混混合合溶溶液液，，采用凝胶过滤法就很容易分离采用凝胶过滤法就很容易分离 三、去热源物质三、去热源物质去热源物质常常是各种注射剂中的一个难题去热源物质常常是各种注射剂中的一个难题虽虽然然已已有有一一些些方方法法(如如活活性性炭炭吸吸附附、、离离子子交交换换吸吸附等附等)处理，但均不如凝胶过滤方便处理，但均不如凝胶过滤方便 所所谓谓热热源源物物质质可可能能是是糖糖蛋蛋白白一一类类大大分分子子物物质质一一般般在在制制备备水水解解蛋蛋白白、、核核苷苷酸酸和和酶酶注注射射液液时时，，采用凝胶过滤法去除热源物质效果较好。

采用凝胶过滤法去除热源物质效果较好  四、测定分子质量四、测定分子质量 原原理理：： Kav值值与与蛋蛋白白质质分分子子质质量量〔〔M〕〕之之间间存存性关系，即：性关系，即： Kav= - b lgM + c 先先，，用用分分子子质质量量的的标标准准物物质质进进行行过过滤滤层层析析后后求求标标准曲线 将将已已知知分分子子质质量量的的标标准准物物质质，，在在同同一一凝凝胶胶柱柱上上以以相相同同条条件件进进行行过过滤滤层层析析物物质质分分子子质质量量不不同同，，故洗脱体积也不同故洗脱体积也不同 根根据据洗洗脱脱体体积积求求出出Kav值值，，依依Kav= -b lgM + c，绘出一条标准曲线绘出一条标准曲线后后，，在在同同样样条条件件下下，，进进行行未未知知分分子子质质量量物物质质的的过过滤层析后求出其滤层析后求出其Kav值 以此值在标准曲线上就能求出其分子质量以此值在标准曲线上就能求出其分子质量用用该该方方法法测测定定分分子子质质量量，，操操作作简简便便，，容容易易掌掌握握，，需要样品量较少，故实用价值颇大需要样品量较少，故实用价值颇大  1．．用用凝凝胶胶柱柱层层析析制制作作测测定定蛋蛋白白质质分分子子质质量量标标准曲线的方法准曲线的方法操作要点操作要点装柱装柱 取取葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶G-100，，处处理理后后按按要要求求装装柱柱(2cm×60cm)，令夹层温度为，令夹层温度为34～～35℃℃。

上样上样 蛋蛋白白质质样样品品：：巨巨球球蛋蛋白白3.7mg N-乙乙酰酰酪酪氨酸乙酯氨酸乙酯0.3mg 核核糖糖核核酸酸酶酶3.7mg 细细胞胞色色素素C 3.0mg 胰胰蛋蛋白白酶酶3mg 卵卵清清白白蛋白蛋白3rug 血清白蛋白单体血清白蛋白单体3mg洗脱洗脱 用用离离子子强强度度为为0.02～～0.05的的中中性性磷磷酸酸缓缓冲冲液液洗洗脱 流速流速0.62ml／／min左右，记录左右，记录280nm消光值n求细胞色素C的Kav值： n       Vo = 67.8ml     n       Vt -Vo  = 150.8ml n       Ve -Vo  = 105.2ml n         Kav = (Ve-Vo)/(Vt-Vo) = 105.2/150.8=0.70n求出其他蛋白质的Kav值n  用同样的方法可求出其他蛋白质的Kav值(见表6-9)。

 n绘制的曲线n  以Kav值为横坐标，以lgM为纵坐标，绘制的曲线如图6-14 为何Vo不恒定？61.4 ~ 67.8实验误差n另一方法：另一方法：n 根据不同蛋白质的分子质量与其相应洗脱体积的关根据不同蛋白质的分子质量与其相应洗脱体积的关系，分别以它们的值作横坐标和纵坐标，照样可绘出系，分别以它们的值作横坐标和纵坐标，照样可绘出标准曲线标准曲线(见图见图6-15)n 此法不仅适合测定大分子质量的物质，而且也适合此法不仅适合测定大分子质量的物质，而且也适合测定一万以下的小分子质量的物质测定一万以下的小分子质量的物质(见图见图6-16) n     用凝胶过滤层析法测定分子质量有如下局限性：n   ①洗脱液在pH6～8的范围内，Kav=-blgM+c的线性关系比较好而在极端pH值时，要防止因变性引起偏离n  ②一般球状蛋白质的轴比虽有差异，但IgM与Kav值的线性关系依然维持n    而纤维状蛋白质轴比大，不能运用上述公式如血纤维蛋白就属这种情况 n③糖蛋白中糖占的比例大于5％时，测得的分子质量偏大这可能是糖在溶液中有较大的水合值所致n        而铁蛋白与糖蛋白情况相反，故测出的分子质量比实际值小。

推测这一现象的发生是由于铁的存在使蛋白质外壳的结构更加紧凑之故n④变性剂(如尿素)和盐酸胍存在时，只要在同样的条件下测出标准曲线，依然遵守上述公式的关系n⑤有些酶类如淀粉酶能与葡聚糖凝胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在凝胶层析时有异常反应  2．用葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子质量．用葡聚糖凝胶薄板测定蛋白质分子质量 葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶薄薄板板层层析析和和普普通通凝凝胶胶层层析析相相类类似似，，被被分分离离物物质质的的分分子子质质量量和和层层析析特特征征之之间间同同样样有有十分密切的关系，即：十分密切的关系，即： 不不同同蛋蛋白白质质的的相相对对迁迁移移距距离离和和它它们们的的分分子子质质量量对数值之间呈线性关系对数值之间呈线性关系。