【最新word论文】千里光水浸液对大肠埃希菌R质粒的消除作用【药学专业论文】.doc

1千里光水浸液对大肠埃希菌 R 质粒的消除作用作者：张文平曹镐禄张文书黄真【摘要】目的探讨千里光对大肠埃希菌 R 质粒消除作用方法对尿路感染患者尿液中分离的大肠埃希菌 R 质粒进行检测，并选用中药千里光水浸液对该质粒进行了体外、体内消除实验体外实验：千里光水浸液亚抑菌浓度分别作用大肠埃希菌 24，48，72h 后，影印培养，计数消除子数；体内实验：建立肠道去污染小鼠动物模型后，经口感染大肠埃希菌，同时给千里光水浸液，灌胃给药，每只2mg/d，分别于给药后 24，48，72h 后处死小鼠，分离培养细菌，计数消除子数消除子经质粒抽提琼脂糖凝胶电泳鉴定结果体外药物作用 24，48，72h 后，R质较消除率分别为：0.2%，2.2%，3.8%；SDS 对照组分别为 12.1%，14.9%，23.7%，体内药物作用 24，48，72hR 质粒消除率分别为 0%，3.1%，14.4%，对照组分别为 0%，0.1%，0.1%结论中药千里光水浸液对大肠埃希菌 R 质粒于体内、体外均具有消除作用，体内消除作用强于体外关键词】千里光大肠埃希菌 R 质粒消除Abstract:ObjectiveToexploretheeliminationeffectofSenecioscandensBuch-Ham(SSB)LiquidExtractsonRplasmid(RP)ofEscherichiacoil．MethodsRPofE.coilwereisolatedfromtheurineofurinarytractinfectionpatients,andtheeliminationtestofSSBextractsontheseplasmidswasperformedinvitroandinvivo.Aftersub-bacteriostaticconcentrationofSSBextractstreatedE.coilinvitrofor24h,48hand72h.Replicaplatingandcountingofcoloniesresistingtoantibioticswerecarriedout.Germ-freemiceinintestinewereorallyinoculatedwithE.coil,thenwaterdecoctagentofSSBwasgivenorallyin2mg/dpermouse,EliminantofE.coilwasidentifiedbyreplicaplatingandcolonycountingafter24h,48hand72h,respectively．RPeliminatedbodieswereidentifiedthroughelectrophoresiswithagarosegel.ResultsAfterdrugactedonE.coil24h,48hand72hinvitrorespectively,eliminationrateofRPinSSBtestedgroupwere0.2%,2.2%,3.8%,whileincontrolSDSgroupwere12.1%,14.9%,23.7%，respectively;24h,48h,72hinvivo,eliminationrateofRPintestgroupwere0,3.1%,14.4%,andincontrolgroupwere0,0.1%,0.1%,respectively.ConclusionSSBhasstrongfunctiontoeliminateRPofE.coilinvivoandinvitro.Theeliminativeeffectisstrongerinvivothaninvitro.Keywords:SenecioscandensBuch-Ham;Escherichiacoil;Rplasmids;Elimination大肠埃希菌作为条件致病菌是医院内感染最常见病原菌之一，其耐药菌株引起的感染日益增多。

细菌的耐药性由染色体或耐药质粒(R 质粒)介导，耐药质粒可通过接合、转化、转导等方式在不同菌种之间传递，使敏感菌成为耐药株，造2成了 R 质粒的流行［1］ 影响 R 质粒传播的因素主要是由于抗生素的滥用，即抗生素的使用起到了选择作用，使含有 R 质粒的菌株得以生存、扩增将 R 质粒从宿主菌中消除，使其恢复对抗生素的敏感性，是临床治疗多重耐药菌感染的新思路［2］ 用人工方法消除 R 质粒国内外曾有报道［3］ 本实验用中药千里光水浸液作为消除剂，对大肠埃希菌 R 质粒进行体内、体外消除实验，观察千里光对耐药质粒的消除作用，探讨其临床应用的可能性1 材料1.1 菌株大肠埃希菌(E.coil)，从赣南医学院第一附属医院尿路感染患者尿中分离并鉴定为大肠埃希菌1.2 药品与试剂千里光购于江西赣南医学院附属医院中药房，取干燥生药 50g，加适量水煮沸 30min，过滤，药渣再加水煮沸 30min，过滤，合并两次滤液，浓缩到 50ml，即得 1g/ml 千里光水浸液营养琼脂为上海医学化验所产品；LB 肉汤培养基(每毫升中含蛋白胨 1g，酵母抽提物 5g，氯化钠 5g，葡萄糖 1g，pH7.2)；十二烷基硫酸钠(SDS)购于华美生物工程公司；四环素（TC） 、氨苄青霉素(AP)、链霉素(SM)均系国产标准品。

1.3 动物昆明小鼠 30 只，6～8 周龄，体重 18～20g，雌雄不限，由赣南医学院实验动物部提供2 方法2.1 实验菌耐药性测定以平板稀释法［4］测定各抗生素对大肠埃希菌的最小抑菌浓度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)2.2 体外消除实验按文献［5］方法进行将大肠埃希菌接种于 LB 肉汤培养基中，37℃过夜振荡培养，调菌液浓度 1.5×109cfu/ml取菌液 5μl 分别加入含不同浓度千里光(自 100mg/ml 开始，倍比稀释至第 7 管，第 8 管不加药为空白对照管)的 LB 肉汤培养基中，每管 LB 培养基总量为 1ml37℃振荡培养 24，48，72h 后取出，观察细菌生长现象，判定亚抑菌浓度从亚抑菌浓度管中取 50μl 菌液分别划线接种于 10 块 4%琼脂平板培养基上，37℃培养 24h，待长出单个菌落后，挑取单个菌落 1000 个，以影印培养法，依次转接于含 TC(20μg/ml)，SM(40μg/ml)或3AP(20μg/ml)的药物平板上以及不含药物的 4%营养琼脂平板培养基上，37℃培养 24h，观察并记录结果挑取在无药平板上生长而在含药物平板不长的菌落，即初步确定为 R 质粒消除子，再经相同抗菌药物平板复试以后，最后确定为 R 质粒消除子。

将搜集到的消除子与原菌液同时按文献［6］快速抽提质粒 DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳，以检测质粒带的消失情况另设 SDS 阳性对照组和空白对照组，消除实验方法同上2.3 体内消除实验2.3.1 建立大肠埃希菌肠道感染的小鼠模型［7］将实验用小鼠均置消毒过的塑料笼内于无菌箱内饲养第 1 天，每只小鼠经灌胃法给四环素 5mg，红霉素1mg，8h 后给利福平 6mg另外，饲以经高压灭菌的饮料块和含四环素(0.5mg/ml)，红霉素(0.01mg/ml)的无菌饮水第 2～3 天每只小鼠给利福平 6mg，第 4～5 天每只小鼠给四环素 2mg，用大肠埃希菌(菌液浓度 1.5×109cfu/ml)0.2ml/只经口感染，饮水和饮料同前2.3.2 大肠埃希菌 R 质粒的消除从第 6 天起将模型小鼠隔离，并随机分 6 组，即 3 个实验组及相应对照组，每组 5 只实验组灌胃给予千里光水浸液(每只 2mg/d)，对照组不给任何药物同时，所有小鼠均禁食，但给经煮沸消毒的含蔗糖(10%)、氯化钠(0.8%)、碳酸氢钠(0.10%)的饮水给药后分别于 24，48，72h 后处死小鼠，取盲肠内容物接种在 4%营养琼脂平板培养基上，37℃培养 24h，分离单个菌落，每组随机挑取 1000 个菌落影印培养，计数消除子数，再经质粒抽提，琼脂糖凝胶电泳鉴定，步骤同上。

2.4 统计学分析各组实验数据釆用 SPSS10.0 统计软件处理，进行采用 χ2 检验3 结果3.1 大肠埃希菌对抗生素耐药性检测结果TC，SM，AP 对大肠埃希菌 MIC 均>800μg/ml，呈高度耐药，千里光对大肠埃希菌 MIC 为 12.5mg/ml3.2 体外消除实验千里光体外作用大肠埃希菌 24h 后，其消除结果与空白对照组比较，无明显差异(P>0.05)；体外作用 48h 与 72h 后，其消除结果与空白对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)，表明千里光体外有消除大肠埃希菌 R 质粒作用，但其消除作用低于 SDS 对照组(P<0.01)结果见表 1表 1 千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌 R 质粒体外消除的影响（略）3.3 体内消除实验千里光体内作用大肠埃希菌 24h，其消除结果与对照组经卡方检验4P>0.05，无显著性差异；48h 与 72h 消除结果经卡方检验 P<0.01，有极显著性差异，表明千里光体内对大肠埃希菌 R 质粒也有消除作用结果见表 2表2 千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌 R 质粒体内消除的影响（略）3.4 消除 R 质粒的表型千里光在小鼠体内 R 质粒的消除实验中，试验菌株的耐药性可表现为单一或多重(二耐以上)耐药性的丢失，而体外消除实验和对照组R 质粒的丢失表现为单一耐药性的丢失。

3.5 消除子的质粒检测结果原始株与消除子经碱裂解法快速抽提质粒 DNA，琼脂糖凝胶电泳观察发现消除子均都丢失 1 至数条质粒带，表明在千里光作用下，质粒被消除4 讨论质粒编码所产生的细菌耐药性和毒力等问题，给人类疾病治疗带来了很大困难，肠道耐药基因库的存在是肠道致病性耐药菌株流行的潜在危险消除耐药质粒，使耐药菌株恢复敏感性，对于治疗临床上由耐药菌导致的感染和阻断耐药性和毒力的传播都有非常重要的意义质粒具有自然丢失与人工消除的特性，但 R 质粒自发消除很缓慢，其消除频率为 10-2～10-8［8］ 自 20 世纪 60 年代以来，人们发现各种理化因素均可消除 R 质粒，如高温培养、紫外线照射、电穿孔法、SDS、高温 SDS 双重处理、嗅化乙锭、丫啶橙等可影响 R 质粒消除，抗生素也具有 R 质粒消除作用［3］ R 质粒消除后细菌的耐药性也随之丧失，R 质粒与染色体突变不同，R 质粒消除后其耐药性不再恢复，除非外源 R 质粒再次转入，但由于这些物理化学因素对人体均有较强的毒副作用，不便投入临床应用［3］ 中药属于天然植物药，毒副作用小，应用安全中药的质粒消除研究始于 20 世纪 80 年代，1983 年徐建国等报道用黄连素消除去污染小鼠体内痢疾杆菌的 R 因子；1985 年陈小英［2］报道用大黄素消除金黄色葡萄球菌的耐药质粒，此后陆续有相关研究报道，但多为抗菌能力强的清热解毒或清热燥湿类中药。

本实验选用的千里光为对大肠埃希菌具有较强抑制作用的清热解毒类中药，MIC 为 12.5mg/ml，故选其作为消除剂结果表明：千里光对大肠埃希菌 R 质粒具有消除作用，且体内消除作用强于体外，其可能原因是在体内细菌不仅受到药物的作用，同时受到机体的内环境，特别是免疫因素影响R 质粒的消除不仅表现为单一耐药性的丢失，还表现为多重耐药性的丢失；消除 R 质粒最佳时间为体外 48h(P<0.01)，体内 72h(P<0.01)中药千里光在临床上不但可用于体外，也可用于体内，其抗菌能力的强弱与其对细菌质粒消除率的大小之间是否存在相关性还不清楚，因此有关千里光水浸液对 R 质粒的消除机制有待进一步研究参考文献】［1］MandicA,OstojicN.Theroleandimportanceofplasmidresistanceincertai。