补充2酶催化活性的测定方法.ppt

补补 充充 2 2　　酶催化活性的测定方法酶催化活性的测定方法目目 的的掌握掌握定时法定时法和和连续监测法连续监测法测定酶活性的原理及方法测定酶活性的原理及方法一、测定酶促反应速度的两类方法一、测定酶促反应速度的两类方法（一）酶促反应速度的表示方法（一）酶促反应速度的表示方法 单位时间的底物的消耗量（单位时间的底物的消耗量（- -d[Sd[S]/min]/min）） 单位时间的产物的生成量（单位时间的产物的生成量（d[Pd[P]/min]/min）来表示）来表示（二）测定方法分类（二）测定方法分类 定时法定时法 在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度在一定时间内通过测定总变化量再计算出速度. . 连续监测法连续监测法 直接用来测定速度直接用来测定速度（一）定时法（一）定时法1.1.概念概念 在足量的底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一在足量的底物系统中，加入一定量的酶试剂，反应一定时间后，加入终止剂终止反应，然后测定底物的消耗量或产定时间后，加入终止剂终止反应，然后测定底物的消耗量或产物的生成量物的生成量2.2.酶活性的结果计算酶活性的结果计算 假设某一样品的酶活性为假设某一样品的酶活性为X X（（U/LU/L），取样品量），取样品量VsVs毫升与底毫升与底物缓冲液物缓冲液VrVr毫升孵育，经过毫升孵育，经过t t分钟反应，加入终止液分钟反应，加入终止液 Ve(mlVe(ml) )，，检测到产物净吸光度增加为检测到产物净吸光度增加为A A，该产物的摩尔消光系数为，该产物的摩尔消光系数为 εε（终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准求得）比色皿光径（终点法的摩尔消光系数一般可通过带标准求得）比色皿光径为为b(cmb(cm) )若把若把A/tA/t以以ΔA/minΔA/min表示，则此定时法测定酶活性的计算公式与连续监测法相同表示，则此定时法测定酶活性的计算公式与连续监测法相同3.3.定时法与终点法和两点法的区别定时法与终点法和两点法的区别Ø定时法定时法 是经过一定时间（固定的时间）反应后终止反应是经过一定时间（固定的时间）反应后终止反应 Ø终点法终点法 指反应基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需指反应基本达到平衡，信号变化很小，但可以不需要终止反应要终止反应Ø两点法两点法 监测反应过程中的两个点，即某一段时间内的底物监测反应过程中的两个点，即某一段时间内的底物或产物的变化或产物的变化（二）连续监测法（二）连续监测法1.1.原理原理 连续监测法是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度连续监测法是将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（等）下孵育，每隔一定时间（2-60s2-60s）连续测定酶促反应过程中）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号（如某一底物或产物的特征信号（如NADHNADH在在340nm340nm的吸光度）的变化，的吸光度）的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率从而计算出每分钟的信号变化速率2.2.酶促反应动力学曲线酶促反应动力学曲线 一个典型的酶促反一个典型的酶促反应过程一般包括延滞应过程一般包括延滞期、线性期和非线性期期、线性期和非线性期1.1.延滞期延滞期 ① ①对单一酶促反应而言对单一酶促反应而言，是指酶促反应从开始到达最大反应，是指酶促反应从开始到达最大反应速度所需要的间，包括速度所需要的间，包括酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合酶催化位点的暴露、底物解离后与酶结合位点的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活位点的结合、酶与辅酶的结合、酶的激活等等等等 ② ②对于酶偶联反应而言对于酶偶联反应而言，延滞期还包括中间产物堆积到一定，延滞期还包括中间产物堆积到一定程后，导致指示反应速度增加，直到与待测酶酶促反应速度达到程后，导致指示反应速度增加，直到与待测酶酶促反应速度达到平衡所需的时间。

一般来说，辅助酶越多，延滞期越长平衡所需的时间一般来说，辅助酶越多，延滞期越长2.2.线性期线性期 是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响是指酶促反应速度保持恒定的时期，不受底物浓度的影响此期底物虽被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应的速度，即此期底物虽被不断消耗但还不足以明显改变酶促反应的速度，即以初速度进行以初速度进行3.3.非线性期非线性期 随着反应的进行，底物消耗越来越明显，反应速度明显下降随着反应的进行，底物消耗越来越明显，反应速度明显下降而进入非线性期酶浓度越高在选定条件下线性期就越短其他而进入非线性期酶浓度越高在选定条件下线性期就越短其他造成进入非线性期的原因有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变造成进入非线性期的原因有可逆反应增强、产物抑制增加、酶变性失活增加、酶聚合或解离增加等等性失活增加、酶聚合或解离增加等等（二）连续监测法酶活性的结果计算（二）连续监测法酶活性的结果计算 假设某一样品的酶活性为假设某一样品的酶活性为x x（（U/LU/L），取样品量），取样品量V Vs s与底物缓冲液与底物缓冲液V Vr r孵育，延滞期为孵育，延滞期为t t0 0分钟，测定间隔时间为分钟，测定间隔时间为t t1 1分钟，读数次数为分钟，读数次数为n n，每间隔时间吸光度变化平均值为，每间隔时间吸光度变化平均值为A A，该产物的摩尔消光系数为，该产物的摩尔消光系数为εε比色皿光径为比色皿光径为b b（（cmcm）。

反应速度分别用产物的生成速度和样品中）反应速度分别用产物的生成速度和样品中酶的催化能力来表示酶的催化能力来表示 二、酶活性测定方法原理二、酶活性测定方法原理 （一）直接法（一）直接法 根据待测酶的酶促反应底物或产物有特征性的理化性质，根据待测酶的酶促反应底物或产物有特征性的理化性质，然后通过特殊的仪器直接检测然后通过特殊的仪器直接检测1.1.基于基于NADHNADH或或NADPHNADPH的反应原理的反应原理 NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm处有特处有特异吸收峰，而异吸收峰，而NAD+NAD+或或NADP+NADP+只在只在260nm260nm处有明显的吸收峰，监处有明显的吸收峰，监测测340nm340nm吸光度变化可以反应吸光度变化可以反应NADHNADH或或NADPHNADPH的变化利用该原的变化利用该原理可以理可以测定以测定以NADNAD（（P P））+ +或或NADNAD（（P P））H H为辅酶的氧化还原酶为辅酶的氧化还原酶例如例如LDLD、、G-6-PDG-6-PD、、α-HBDα-HBD、、ADAD、、SDSD、、GLDHGLDH等等 一些水解酶类或转移酶类经过酶促反应将化合物中的某一些水解酶类或转移酶类经过酶促反应将化合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物。

一基团水解或移去，使无颜色的底物转变为有颜色的产物人们把这类底物称为色素原底物根据这一原理，人们有意人们把这类底物称为色素原底物根据这一原理，人们有意识地合成一系列底物用来测定酶活性，即人工合成色素原底识地合成一系列底物用来测定酶活性，即人工合成色素原底物，利用这类底物测定的酶物，利用这类底物测定的酶2．基于人工合成色素原底物反应原理．基于人工合成色素原底物反应原理色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数4-硝基磷酸酚钠盐ALPPNP（4-硝基酚405nm）,18.53-羧基-γ-L-谷氨酰对硝基苯胺GGT5-氨基-2-硝基苯甲酸,405nm,9.872-氯-硝基苯-α-半乳糖-麦芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP405nm）,6.23.3.基于氧的消耗基于氧的消耗 氧化酶在催化反应时会不断消耗氧气，可以设计氧电极来氧化酶在催化反应时会不断消耗氧气，可以设计氧电极来连续监测氧的消耗速度连续监测氧的消耗速度4.4.其他其他 胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生乙酸，造成胆碱酯酶催化乙酰胆碱产生乙酸，造成pHpH下降，可以用下降，可以用pHpH差示法测定胆碱酯酶脱羧酶在反应过程中产生差示法测定胆碱酯酶。

脱羧酶在反应过程中产生CO2CO2，可以用，可以用量积法测定量积法测定 （二）间接法（二）间接法 是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，是指酶促反应底物和产物之间没有特征性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有需通过另一个化学反应或生化反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性质的另一个化合物用直接法来测定的酶类明显特征理化性质的另一个化合物用直接法来测定的酶类非常有限，很多情况下不得不使用间接法非常有限，很多情况下不得不使用间接法  大多数定时法都是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底大多数定时法都是在酶促反应终止后加入另一个试剂与底物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测也物或产物反应，转化为有色化合物，再用分光光度法检测也有个别酶类不终止反应，加入与酶促反应无关的试剂，但能与有个别酶类不终止反应，加入与酶促反应无关的试剂，但能与酶促反应的某一产物反应生成有特征性的化合物酶促反应的某一产物反应生成有特征性的化合物例如：例如：①①胆碱酯酶胆碱酯酶催化酰基硫代胆碱类底物后，生成的硫代胆催化酰基硫代胆碱类底物后，生成的硫代胆碱（碱（SChSCh）与）与5 5，，5-5-二硫代二硫代- -双（双（2-2-硝基苯甲酸）（硝基苯甲酸）（DTNBDTNB）反应，）反应，生成黄色阴离子生成黄色阴离子5-5-巯基巯基-2--2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（5-TNBA5-TNBA）） ②②酸性磷酸酶酸性磷酸酶测定，利用测定，利用α-α-萘酚磷酸盐做底物，经酸性萘酚磷酸盐做底物，经酸性磷酸酶水解后释放萘酚，与试剂中的固红磷酸酶水解后释放萘酚，与试剂中的固红TRTR发生偶氮反应，生发生偶氮反应，生成黄色化合物成黄色化合物 1.1.化学法化学法 在酶活性测定时，常采用另一个（指示酶）或几个酶（辅助在酶活性测定时，常采用另一个（指示酶）或几个酶（辅助酶和指示酶）将测定酶的某一产物转化为新的产物，当其他酶的酶和指示酶）将测定酶的某一产物转化为新的产物，当其他酶的反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速反应速度与待测酶反应速度达到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待测酶的活性。

可以表示为：度来代表待测酶的活性可以表示为：Ø指示酶指示酶是指能监测反应速度的酶是指能监测反应速度的酶Ø辅助酶辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要辅助酶在酶偶联反应中可以一个或多个，也可以不需要辅助酶 由于由于NADNAD（（P P））+ +或或NADNAD（（P P））H H在在340nm340nm的光吸收特性，很容易进的光吸收特性，很容易进行连续监测，因此它是最常用的指示酶，过氧化物酶（行连续监测，因此它是最常用的指示酶，过氧化物酶（PODPOD）也）也可做指示酶下表列举了需要指示酶的酶偶联方法来测定酶活性可做指示酶下表列举了需要指示酶的酶偶联方法来测定酶活性 2.2.酶偶联法酶偶联法待测酶测定方法辅助酶指示酶丙氨酸氨基转移酶IFCC推荐法LD脂肪酶GK-GPO-POD法GK、GPO、POD5’-核苷酸酶5’-IMP作底物的NP-XOP-POD法核苷磷酸化酶NP黄嘌呤氧化酶XODPOD举举 例例。