任务二 繁育新技术.doc

任务二任务二 繁育新技术繁育新技术目的：目的：紧跟科技发展前沿，了解畜禽繁育新技术知识：知识：了解胚胎移植、克隆技术的发展历程及成果能力：能力：熟知胚胎移植的基本程序素质：素质：会通过多种渠道、手段搜集信息、交流信息和综合处理加工信息，关心日常生活中出现的新事物一、胚胎移植一、胚胎移植（一）、发展历程（一）、发展历程动物胚胎移植技术历时 20 年的发展，对牛来说，在无手术情况下，可一次冲卵 30 枚，平均可用胚胎数为 5.5 枚/头超数排卵和胚胎移植（MOET）育种计划在至少 8 个国家得到全面实行，遗传改良进展比预期提高了 10%奶牛胚胎移植的总数正在逐年增加，全球 1997 年移植胚胎数接近 460,000，现在每年大约 500,000 枚左右在美国，奶牛生产群中有 0.2%的母牛是通过胚胎移植获得，但 95%以上的种公牛和优良种母牛是胚胎移植获得的七五”和“八五”期间，我国“863”计划、国家攻关计划、农业部重点攻关计划和部分省市的研究计划都重点支持了动物胚胎移植技术的研究与开发，包括胚胎分割、卵母细胞体外成熟、体外人工授精、核移植技术等，并利用体外受精和胚胎移植技术繁育了大量的优良种畜，如内蒙古共生产良种牛胚胎 3 万多枚，建立中试移植基地 4 处，几年来共移植受体 1000 余头（次），获得试管牛犊 300 余头；新疆与宁夏已建成 700 余头供体牛的牛胚胎移植产业化基地，生产良种牛胚胎 1530余枚，进口安格斯肉牛胚胎 1300 余枚，移植受体牛 300 头，冻胚平均妊娠率 40%以上；北京、河南、山东、黑龙江、广西等地也获得了较大数量的胚胎移植优质牛。

内蒙古在国家计委的支持下，建立了 10 万枚优质羊的胚胎移植基地，1000 多只试管羊已经出生；国家计委还先后支持了北京市奶牛中心、江西金牛集团、广西大学等建立奶牛胚胎移植中心并进行大规模的产业化奶牛胚胎生产目前，我国奶牛的胚胎移植数量已接近 10,000 枚左右/年，在发展中国家处于先进水平据不完全统计，我国有以胚胎移植技术为核心的生物技术公司 32 家由中国奶牛协会、中国农业大学、中国农业科学院畜牧研究所、北京奶牛中心等单位承担的“中国荷斯坦奶牛 MOET育种体系的建立与实施”项目以及内蒙古大学和广西大学等主持的“牛体外受精技术的研究与开发”项目，研究开发结果达到了国际先进水平，在 2000 年分别授予了国家科学技术发明二等奖1997 年 2 月,世界上第一只体细胞克隆绵羊—“多莉”在英国诞生这一成果开创了哺乳动物体细胞克隆的里程碑一时间，世界范围内刮起了强劲的“克隆”旋风, 体细胞克隆小鼠、山羊、牛、猪等都相继出世我国科学家在利用胚胎细胞作为核供体来产生克隆动物的研究方面一度处于国际先进水平，新疆畜牧科学院、西北农业大学、东北农业大学等利用胚胎细胞克隆生产出了克隆牛、克隆羊和克隆猪；特别是在 1995 年，获得过 45 只再克隆的胚胎克隆山羊，是当时世界上最大的胚胎克隆羊群体，但我国没能够在体细胞克隆技术方面获得突破。

1999 年 10 月中科院发育所和扬州大学合作成功地克隆出转基因体细胞克隆山羊；同年，我国台湾省畜产研究所在克隆猪上取得了成功；2000 年 6 月西北农林科技大学再次成功获得了体细胞克隆山羊“元元”和“阳阳”，标志着我国动物体细胞克隆技术的崛起2001 年我国动物胚胎移植技术再次取得重要进展，仅奶牛胚胎移植的数量就达到 11,000 余枚，其中直接从国外进口的优良胚胎数量接近 5000 枚同年，我国优良水牛的胚胎移植成功率也获得突破性进展优良种绵羊（如多赛特）和山羊(如波尔山羊)的胚胎需求量激增，全年胚胎移植数量已超过 20,000 枚2001 年我国不仅在奶牛胚胎移植的数量上有很大发展，而且技术水平也已经达到国际先进水平，高产奶牛超数排卵技术每头生产可用胚胎 6-8 枚，鲜胚移植妊娠率达到 60%，冷冻胚胎移植妊娠率为 50%以上2001 年我国在体细胞克隆牛方面也取得了突破性进展2001年 10 月克隆奶牛在深圳市绿鹏公司转基因动物繁殖基地诞生2001年 11 月山东莱阳农学院的科学家成功地克隆了 2 头健康的日本黑牛“康康”和“双双”2002 年 3 月至 5 月，中国科学院动物研究所和中国农业大学的科学家们已经能够在国内成功生产体细胞克隆牛胚胎，并已开始了较大规模的体细胞克隆胚胎的移植试验，其各项技术指标均已接近或达到国际先进水平。

二）、胚胎移植的基本程序（二）、胚胎移植的基本程序胚胎移植的基本程序包括供体超排与授精，受体同期发情处理、采卵、检卵和移植关于超排和同期发情处理在前面已有叙述，本书仅介绍采卵、检卵和移植1．胚胎回收(采卵) 从供体收集胚胎的方法肴手术法和非手术法两种1)手术法 按外科剖腹术的要求进行术前准备手术部位位于右肋部或腹下乳房至脐部之间的腹白线处切开伸进食指找到输卵管和子宫角，引出切口外如果在输精后 3—4 天期间釆卵，受精卵还未移行到子宫角，可采用输卵管冲卵的方法将一直径 2 毫米，长约 10 厘米的聚乙烯管从输卵管腹腔口插入 2—3 厘米，另用注射器吸取 5—10 毫升 30℃左右冲卵液，连接 7 号针头，在子宫角前端刺人，再送人输卵管峡部，注入冲卵液穿刺针头应磨钝，以免损伤子宫内膜；冲洗速度应缓慢，使冲洗液连续地流出如果在输精后 5 天收胚，还必须做子宫角冲胚即用 10 一 15 毫升冲卵液由宫管结合部子宫角上部向子宫角分叉部冲洗为了使冲卵液不致由输卵管流出，可用止血钳夹住宫管结合部附近的输卵管，在于宫角分叉 部插入回收针，并用肠钳夹住子宫与回收针后部，固定回收针，并使冲卵液不致流人子宫体内。

2)非手术法 非手术采卵一般在输精后 5—7 天进行可采用二路导管的冲卵器二路式冲卵器是由带气囊的导管与单路管组成导管中一路为气囊充气用，另一路为注入和回收冲卵液用导管中插 1 根金属通杆以增加硬度，使之易于通过子宫颈一般用直肠把握法将导管经子宫颈导人子宫角为防止子宫颈紧缩及母牛努责不安，采卵时可在腰荐或尾椎间隙用 2％的普鲁卡因或利多卡因 5—10 毫升进行硬膜外腔麻醉操作前洗净外阴部并用酒精消毒为防止导管在阴道内被污染，可用外套膜(有商品出售)套在导管外，当导管进人子宫颈后，扯去套膜将导管插入一侧子宫角后，从充管向气囊充气，使气囊胀起并触及子宫角内壁，以防止冲卵液倒流然后抽出通杆，经单路管向子宫角注入冲卵液，每次15—50 毫升，冲洗 5—6 次，并将冲卵液收集在漏斗形容器中为更多地回收冲卵液，可在直肠内轻轻按摩子宫角用同样方法冲洗对侧子宫角冲卵液多数为组织培养液，如林格氏液、杜氏磷酸盐缓冲液(PE)、布林斯特氏液(BMOC-3)和 TCM—199 等常用的为杜氏磷酸盐缓冲液，加入 0．4％的牛血清白蛋白或 1％一 10％犊牛血清冲卵液温度使用时应为 35—37℃，每毫升要加入青霉素 1000国际单位，链霉素 500—1000 微克，以防止生殖道感染。

2．胚胎检查(1)检卵 将收集的冲卵液于 37℃温箱内静置 10 一 15 分钟胚胎沉底后，移去上层液取底部少量液体移至平皿内，静置后，在实体显微镜下先在低倍(10 一 20 倍)下检查胚胎数量，然后在较大倍数(50—100 倍)下观察胚胎质量2)吸卵 吸卵是为了移取、清洗、处理胚胎，要求目标准确，速度快，带液量少，无丢失吸卵可用 1 毫升的注射器装上特别的吸头进行，也可使用自制的吸卵管3)胚胎质量鉴定 正常发育的胚胎，其中细胞(卵裂球)外形整齐，大小一致，分布均匀，外膜完整无卵裂现象(未受精)和异常卵(外膜破裂、卵裂球破裂等)都不能用于移植3．胚胎移植(1)手术移植 先将受体母牛作好术前准备已配种母牛，在右肋部切口，找到非排卵侧子宫角，再把吸有胚胎的注射器或移卵管刺入子宫角前端，注人胚胎；未配母牛在每侧子宫角各注入一个胚胎；然后将子宫复位，缝合切口2)非手术移植 非手术移植一般在发情后第六至第九天(即胚泡阶段)进行，过早移植会影响受胎率在非手术移植中采用胚胎移植枪和 0．25 毫升细管移植的效果较好将细管截去适量，吸入少许保存液，吸一个气泡，然后吸人含胚胎的少许保存液，吸人一个气泡，最后再吸取少许保存液。

将装有胚胎的吸管装入移植枪内，通过子宫颈插入子宫角深部，注入胚胎非手术移植要严格遵守无菌操作规程，以防生殖道感染二、克隆二、克隆（一）、克隆简介（一）、克隆简介克隆是指生物体通过体细胞进行的无性繁殖，以及由无性繁殖形成的基因型完全相同的后代个体组成的种群通常是利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组织后代的过程1997 年 2 月 27 日，英国(Nature}杂志，报道了英国罗斯林研究所 Rodin Institute，Uk 的威尔穆特(I.Wilmut)博士及其同事的题为“从胚胎和成年哺乳动物细胞繁衍后代”的研究论文宣布了首次成功地运用成年母羊乳腺上皮细胞作为细胞核的供体的移植技术克隆了 1 头名叫“多莉”的小绵羊这篇论文，通过媒体传播后，立即引起世界广泛的关注与争议，成为震惊世界的头条新闻自从“多莉”羊问世以来，“克隆”一词广为人知，动物克隆这一领域也逐渐成为生命科学的研究热点目前，在动物界进行过核移植研究的主要有变形虫、两栖类、鱼类、昆虫、脊索椎动物和哺乳类等六大类动物克隆技术根据核供体的来源不同，可分为胚胎细胞克隆技术及体细胞克隆技术，包括胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。

二）、国内外克隆技术成果与进程（二）、国内外克隆技术成果与进程 动物克隆技术发展历史悠久早在 1938 年，Spemann 就通过蝾螈胚胎分割实验证明了自己的核移植设想1952 年，Briggs 和 King 将青蛙卵进行核移植，获得重组胚并发育形成小蝌蚪20 世纪六七十年代两栖类，鱼类也相继克隆成功1981 年，Hoppcs 克隆小鼠成功标志首例哺乳动物克隆成功随后，他采用显微去核和病毒介导相继获得克隆羊、克隆兔、克隆猪1996 年，美国克隆猴获得成功，这是人类首次灵长类克隆成功，并引发克隆人与伦理争论1997 年，英国克隆绵羊“多莉”的诞生，标志体细胞克隆进入一个新的时代1998 年，Wilmut 等利用核移植和转基因技术，成功获得转基因克隆绵羊1999 年，华裔科学家赖良学等通过基因工程和体细胞克隆相结合，成功获得“基因敲除”克隆猪2002 年，华裔科学家杨向中宣布成功获得具有两种人类凝血因子的“双基因”克隆猪我国动物克隆技术早在上个世纪 60 至 70 年代就已开始著名实验胚胎学家童第周曾用囊胚细胞进行鱼类核移植，并于 70 年代获得属间和种间核移植鱼，其利用的“核移植”技术即胚胎细胞克隆技术。

20 世纪 90 年代起，我国科学家开始进行哺乳动物克隆研究，并先后获得克隆山羊(西北农大)，克隆兔(1991 年江苏农学院)、克隆牛(1995、1996 年广西农学院、中国农科院畜牧所)和克隆猪(西北农业大学)，其中克隆山羊的研究和应用处于国际领先水平，只是供体细胞均为胚胎细胞体细胞克隆方面起步比较晚，但这项技术目前我国已经与国际先进水平站在了同一起跑线上至于作用，主要体现在它的应用上克隆技术已展示出广阔的应用前景，概括起来大致有以下四个方面：（1）培育优良畜种和生产实验动物；（2）生产转基因动物；（3）生产人胚胎干细胞用于细胞和组织替代疗法；（4）复制濒危的动物物种，保存和传播动物物种资源能力训练：能力训练：通过多种渠道搜集繁育新技术在各个领域的发展，并绘制繁殖技术的发展历程拓展延伸：拓展延伸：调查了解畜禽繁育新技术在生产上的应用。