第三章-核酸的性质(新).ppt

第三章第三章 核酸的性质核酸的性质1 复习内容2 背景知识介绍3 DNA的一级结构4 DNA的二级结构5 DNA的三级结构——超螺旋6 RNA结构与功能7 核酸性质复习复习1Science杂志评出的2008年十大科学进展(Breakthrough of the year)中细胞重编程被评为第一位细胞重编程(Reprogramming Cells)指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程通过插入回拨细胞发育时钟的基因，研究人员正在深入了解疾病和研究细胞如何决定其命运的生物学 复习复习2* *肽肽肽肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物 * 两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成两分子氨基酸缩合形成二肽二肽二肽二肽，三分子氨基酸缩合则，三分子氨基酸缩合则，三分子氨基酸缩合则，三分子氨基酸缩合则形成形成形成形成三肽三肽三肽三肽…………* * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽寡肽寡肽寡肽(oligopeptide)(oligopeptide)，，，，由更多的氨基酸相连形成的肽称由更多的氨基酸相连形成的肽称由更多的氨基酸相连形成的肽称由更多的氨基酸相连形成的肽称多多多多肽肽肽肽(polypeptide)(polypeptide)。

• •多肽链多肽链多肽链多肽链(polypeptide chain)(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以是指许多氨基酸之间以是指许多氨基酸之间以是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构肽键连接而成的一种结构肽键连接而成的一种结构肽键连接而成的一种结构 * * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为称为称为称为氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基(residue)(residue)概念概念复习复习3在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)或基序或基序大分子蛋白质的大分子蛋白质的三级结构常可分割成三级结构常可分割成一个或数个球状一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为称为结构域结构域结构域结构域(domain)(domain)复习复习4三级结构的主要化学键三级结构的主要化学键三级结构的主要化学键三级结构的主要化学键蛋白质混合物分离方法：蛋白质混合物分离方法：1 1、利用溶解度差异的分离方法、利用溶解度差异的分离方法2 2、根据分子量不同的分离方法、根据分子量不同的分离方法3 3、根据电荷不同的分离方法、根据电荷不同的分离方法4 4、特异性分离、特异性分离复习复习5背景背景 1868年, F.Miescher 就发现了核素（nuclein）。

20世纪20-30年代, 已确认自然界有DNA和RNA两类核酸，并阐明了核苷酸的组成 背景背景40年代以后，实验的事实使人们对核酸的功能和结构两方面的认识都有了长足进步1944年， 等证明了肺炎球菌转化因子是DNA1952年，A.D.Hershey 和 M.Chase 用 35S 和32P 分别标记 T2 噬菌体的蛋白质和核酸，感染大肠杆菌的实验进一步证明了DNA是遗传物质背景背景在对在对DNA结构的研究上结构的研究上1949-1952年，Wilkins 等的X-线衍射分析阐明了核苷酸并非平面的空间构像，提出了DNA是螺旋结构1948-1953年，Chargaff等用新的层析和电泳技术分析组成DNA的碱基和核苷酸量，积累了大量的数据，提出了DNA碱基组成A=T、G=C的Chargaff 规则，为碱基配对的DNA结构认识打下了基础1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，同时提出了DNA复制的可能模型1956年，A.Kornbery首先发现DNA聚合酶（DNA polymerase）1958年，Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验证明了DNA半保留复制模型。

背景背景1961年，Hall和Spiegelman用RNA-DNA杂交证明mRNA与与DNA序列互补序列互补，阐明了 RNA转录合成转录合成的机理60年代，Nirenberg、Ochoa、Khorana等几组科学家的共同努力破译了mRNA上编码合成蛋白质上编码合成蛋白质的遗传密码遗传密码上述重要发现共同建立了以中心法则中心法则为基础的分子遗传学基本理论体系背景背景背景背景1970年，Temin和Baltimore从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶反转录酶，补充和完善了遗传信息传递的中心法则 DNADNA复制复制RNARNAProteinProtein翻译翻译转录转录70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类开始了深入认识生命本质并能动改造生命的新时期期间的重大成就包括：期间的重大成就包括：重组DNA技术的建立和发展基因组研究的发展单克隆抗体及基因工程抗体的建立和发展基因表达调控机理细胞信号转导机理背景背景DNA的一级结构的一级结构构成DNA的碱基可以分为两类，嘌呤（purine）和嘧啶（pyrimidine）嘌呤为双环结构(Bicyclic)，包括腺嘌呤(adenine)和鸟嘌呤(guanine) 。

嘧啶为单环结构(monocyclic)，包括胞嘧啶(cytosine)和胸腺嘧啶(thymine) 核酸分为两类：核糖核酸（ribonucleic acid, RNA）和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）前者是核苷酸的聚合物，后者是脱氧核苷酸的聚合物 碱基：碱基：含有多种取代基的杂环芳香族化合物DNA的一级结构的一级结构DNA碱基：A、G、C、T ；RNA碱基：A、G、C、U 、稀有碱基DNA的一级结构的一级结构戊糖戊糖 有核糖和脱氧核糖DNA：脱氧核糖 RNA：核糖—D—核糖 —D—脱氧核糖DNA的一级结构的一级结构核苷核苷=核糖+碱基DNA的一级结构的一级结构核苷酸 含氮碱与戊糖形成核苷核苷，核苷再与磷酸结合形成核苷酸核苷酸核苷酸核苷酸 = 碱基+核糖（脱氧核糖）+磷酸腺嘌呤核苷酸 （AMP）胸腺嘧啶脱氧核苷酸 （d-TMP）DNA的一级结构的一级结构：：多核苷酸链中，脱氧核苷酸的排列顺序腺嘌呤脱氧核苷酸d-AMP鸟嘌呤脱氧核苷酸d-GMP胞嘧啶脱氧核苷酸d-CMP胸腺嘧啶脱氧核苷酸 d-TMPDNA的一级结构的一级结构DNA的组成单位是脱氧核苷酸（deoxynucleotide）。

脱氧核苷酸有三个组成成分：一个磷酸基团(phosphate)，一个2’-脱氧核糖（2’-deoxyribose）和一个碱基(base) DNA的一级结构的一级结构脱氧单核苷酸脱氧单核苷酸之间的连接方式：连接键: 3’, 5’磷酸二酯键即第一个核苷酸糖环上原来游离的C-3’羟基与第二个核苷酸C-5’磷酸组成3’， 5’磷酸二酯键脱氧寡核苷酸：脱氧寡核苷酸：几个或十几个脱氧核苷酸连接起来形成的分子更多的脱氧核苷酸连接形成的聚合物就是脱氧核酸5'5'末端的末端的磷酸基团磷酸基团3'3'，，5'5'–磷磷 酸二酯键酸二酯键3'3'末端的末端的 羟基羟基DNA的一级结构的一级结构5 ´ pApCpTpGpCpT-OH 3´5´ -A C T G C T- 3 ´DNADNA的书写方式的书写方式 PPPPPOH5 ´3´A C T G C TP一级结构与多样性DNA一级结构的测定• 双脱氧末端终止法-Sanger法：原理是采用核苷酸链终止剂，双脱氧核苷酸ddNTP终止DNA链的延长根据这一方法，就可得到一组以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段。

分成4组，每一组反应体系中加入4种dNTP和一种相应的ddNTP，反应后可得到不同长度的以双脱氧结尾的DNA片段，各DNA片段均只相差一个核苷酸长度，各组的片段经凝胶电泳分离后，每一片段的电泳位置不同，从下而上可直接读出DNA序列DNA一级结构的测定DNA一级结构的测定DNA一级结构的测定DNA的二级结构的二级结构Chargaff规则（规则（1950年）：年）：A=T、G=C、嘌呤＝嘧啶，DNA有个体特异性，无器官、组织特异性；生物进化的亲缘关系越远，其碱基差异就越大双螺旋结构模型双螺旋结构模型DNA的二级结构的二级结构DNA的二级结构的二级结构DNA的二级结构的二级结构Watson—Crick 双双螺螺旋旋结结构构模模型型要点：要点： a. 反平行双链右手螺旋b. 糖－Pi在螺旋线上c. 碱基伸向内部其平面垂直 于轴d. A=T、G=Ce. 直径=2nm，一圈上升10对核苷酸，螺距为3.4nmf. 大沟、小沟；Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋，后续研究表明DNA的结构是动态的在低温、相对湿度较低时，DNA分子的X－射线衍射图给出的是A构象构象，A－DNA的直径是2.6nm，每螺旋含11个碱基对，螺距2.8 nm。

A型DNA的大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅由于大沟、小沟是DNA行使功能时蛋白质的识别位点，所以由B－DNA变为A－DNA后，蛋白质对DNA分子的识别也发生了相应变化RNA及其与DNA杂合体DNA-RNA主要形成A型双螺旋 DNA的二级结构的二级结构Z-型双螺旋除了A型DNA和B型DNA以外，还发现有一种Z型DNAA.Rich在研究CGCGCG寡聚体的结构时发现了这类DNACGCGCG在晶体中呈左手螺旋(left handed)，这种DNA称左旋DNA目前仍然不清楚Z-DNA究竟具有何种生物学功能DNA的二级结构的二级结构A-DNAB-DNAZ-DNADNA的二级结构的二级结构H-DNAH-DNA H-DNA是一种三股螺旋能够形成三股螺旋的DNA序列呈镜像对称，并且一条链为多聚嘌呤链，另一条链为多聚嘧啶链，例如(CT/AG)n DNA的二级结构的二级结构H-DNA可在转录水平上阻止基因的转录阻止基因的转录稳定作用力：稳定作用力：氢键、碱基堆积力(包括纵向的疏水作用力和碱基间电子的相互作用)（主要）、相反电荷作用DNA的二级结构的二级结构DNA的高级结构的高级结构：超螺旋 DNA三级结构是指DNA链进一步扭曲盘旋形成超螺旋结构。

生物体内有些DNA是以双链环状DNA形式存在，如有些病毒DNA，某些噬菌体DNA，细菌染色体与细菌中质粒DNA，真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA都是环状的 环状DNA分子可以是共价闭合环，即环上没有缺口，也可以是缺口环，环上有一个或多个缺口DNA的高级结构的高级结构：超螺旋在DNA双螺旋结构基础上，共价闭合环DNA（covalently close circular DNA）可以进一步扭曲形成超螺旋形根据螺旋的方向可分为正超螺旋和负超螺旋正超螺旋使双螺旋结构更紧密，双螺旋圈数增加，而负超螺旋可以减少双螺旋的圈数几乎所有天然DNA中都存在负超螺旋结构DNA的高级结构的高级结构：超螺旋DNA的拓扑学特征：链环数 (Lk):两条链相交的总次数；缠绕数 (Tw)：一条链绕另一条链的初级螺旋圈数；扭曲数(Wr):双螺旋分子在空间上相对于双螺旋轴心的扭曲，直观上等于超螺旋数Lk = Tw + Wr环状DNA分子常以超螺旋结构存在，并以负超螺旋为主，有利于转录的起始拓扑异构酶（topoisomerase）催化DNA产生瞬时单链或双链断裂而改变连环数(linking number)，从而调控DNA分子超螺旋水平。

拓扑异构酶有两种基本类型，拓扑异构酶I和拓扑异构酶II拓扑异构酶II在DNA上产生一个瞬时的双链缺口，并在缺口闭合以前使另一双链DNA片段得以穿过，连环数每次改变±2拓扑异构酶II依靠ATP水解提供能量来催化这一反应I型拓扑异构酶的作用是使DNA暂时产生单链切口，让另一未被切割的单链在切口接合之前穿过这一缺口，连环数每次改变±1与拓扑异构酶II相比，拓扑异构酶I的作用不需要ATP DNA的高级结构的高级结构：超螺旋RNA和DNA有三点不同之处：第一，RNA骨架含有核糖而不是2’－脱氧核糖，在核糖的2’－位置上带有一个羟基第二，DNA中的胸腺嘧啶被RNA中的尿嘧啶取代，尿嘧啶有着和胸腺嘧啶相同的单环结构，但是缺少5’甲基基团第三，RNA通常以单链形式存在 RNA的结构RNA的结构一级结构:RNA分子中的核苷酸排列顺序称为核酸的一级结构RNA的二级结构:单链核苷酸自身折叠由单链区、茎环结构、内部环、双链结构等元件组成的平面结构，称为RNA的二级结构RNA的二级结构主要由核酸链不同区段碱基间的氢键维系RNA的三级结构:在二级结构的基础上，核酸链再次折叠形成的高级结构称为RNA的三级结构(tertiary structure)。

由于没有形成长的规则螺旋的限制，因此RNA可以形成大量的三级结构 RNA的结构与功能二级结构特点二级结构特点：三叶草形，四环一臂：氨基酸臂、DHU环、反密码环、TC环、额外环tRNA二级结构tRNA三级结构RNA的功能细胞内的细胞内的RNA行使多种生物学功能行使多种生物学功能: :mRNA(messenger RNA)是蛋白质生物合成的模板在真核细胞中，由于蛋白质是在胞浆中而不是在核内合成，因此显然要求有一个中间物将DNA上的遗传信息传递至胞浆中，这种中间物即信使RNA不均一核RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA)：在真核生物中，最初转录生成的RNA称为不均一核RNA，hnRNA是mRNA的未成熟前体RNA的功能两类RNA之间的关系：一、hnRNA核苷酸链中的一些片段将不出现于相应的mRNA中，这些片段称为内含子(intron)，而那些保留于mRNA中的片段称为外显子(exon)也就是说，hnRNA在转变为mRNA的过程中经过剪接，被去掉了一些片段，余下的片段被重新连接在一起；二、mRNA的5′末端被加上一个m7pGppp帽子，在mRNA3′末端多了一个多聚腺苷酸(polyA)尾巴。

RNA的功能tRNA运载氨基酸并识别mRNA的密码子tRNA(transfer RNA)是蛋白质合成中的接合器分子tRNA分子有100多种，各可携带一种氨基酸，将其转运到核蛋白体上，供蛋白质合成使用tRNA是细胞内分子量最小的一类核酸，由70～120核苷酸构成，各种tRNA无论在一级结构上，还是在二、三级结构上均有一些共同特点tRNA中含有10%～20%的稀有碱基(rare bases)，如：甲基化的嘌呤mG、mA，双氢尿嘧啶(DHU)、次黄嘌呤等等此外，tRNA内还含有一些稀有核苷，如：胸腺嘧啶核糖核苷，假尿嘧啶核苷(Ψ，pseudouridine)等RNA的功能rRNA是核糖体的组成部分核蛋白体RNA(ribosomal RNA)是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上原核生物和真核生物的核蛋白体均由易于解聚的大、小亚基组成原核生物小亚基由16SrRNA和21种rp构成，大亚基由5S、23s rRNA和31种 rp构成真核生物核蛋白体小业基含18S rRNA和30多种rp，大亚基含28S、5.8S、5S三种rRNA，近50种rp各种生物核蛋白体小亚基中的rRNA具有相似的二级结构。

RNA的功能小核RNA(snRNA,small nuclear RNA)存在于真核细胞的细胞核内，有U1，U2，U4，U5，U6 snRNA等，均为小分子核糖核酸，长约100-215个核苷酸，其功能是在hnRNA成熟转变为mRNA的过程中，参与RNA的剪接，并且在将mRNA从细胞核运到细胞浆的过程中起着十分重要的作用小胞浆RNA(scRNA,small cytosol RNA)长约300个核苷酸，主要存在于细胞浆中，是蛋白质定位合成于粗面内质网上所需的信号识别体(signal recognization particle)的组成成分RNA的功能MicroRNA (miRNA) 一类由内源基因编码的长度约20-24 个核苷酸的非编码单链RNA 分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控 到目前为止， 在动植物以及病毒中已经发现有28645 个miRNA 分子(Release 21: June 2014) 大多数miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster) 的形式存在于基因组中(Lagos2Quintanaet al , 2001 ; Lau et al , 2001) RNA的功能miRNAmiRNA在细胞内具有多种重要的调节作用在细胞内具有多种重要的调节作用: :每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。

miRNA可能调节着人类三分之一的基因研究表明大约70%的哺乳动物miRNA 基因是位于TUs区( transcriptionunits, TUs) , 且其中大部分是位于内含子区一些内含子miRNA 基因的位置在不同的物种中是高度保守的④miRNA不仅在基因位置上保守, 序列上也呈现出高度的同源性⑤miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系⑥miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系核酸性质物理性质物理性质形态：形态： DNA为白色纤维状固体; RNA为白色粉末状固体溶解性：溶解性： 微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂（有机溶剂可用于分离沉淀）；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小核酸性质核酸的水解：核酸的水解：（一）酸水解 对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键 嘌呤核苷键＞嘧啶核苷键 利用酸水解可以研究核酸的碱基组成二）碱水解 RNA的磷酸酯键和2’位羟基对碱敏感 DNA 抗碱水解核酸性质 核酸酶（三）酶水解核酸性质核酸性质核酸性质两性解离与等电点两性解离与等电点：核苷酸上有碱基，显碱性，同时也有磷酸基团显酸性。

核酸也有等电点，但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性，DNA的pI一般为 4~4.5，RNA的pI为在细胞内，核酸一般带负电，可用电泳分离核酸性质紫外吸收紫外吸收：碱基、核苷、核苷酸和核酸240~290 nm的紫外波段有强烈的光吸收， λmax=260 nm纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0含量计算：含量计算：1 ABS值相当于：50 ug/mL双螺旋DNA或：40 ug/mL单链DNA（或RNA）或：20 ug/mL寡核苷酸判断判断DNADNA是否变性是否变性在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）原因：原因：双链解开，碱基间电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生了增色效应在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）核酸性质变性变性：概念：在物理、化学因素的影响下，DNA双螺旋结构解为单链的现象称为变性变性因素：强酸碱、有机溶剂、高温等等DNA的热变性称为DNA的“融解”，50% DNA分子解链的温度为DNA的熔解温度，用Tm表示核酸性质核酸性质影响核酸变性的因素:1)外因：：凡能破坏氢键和碱基堆积力的因素，都是核酸变性的因素。

如: A 热变性，B 酸碱变性（pH小于4或大于11），C 有机试剂变性（尿素、盐酸胍、甲酰胺）等2)内因：：A.碱基的含量，(AT易变性，GC不易)B.DNA的均一性，C.碱基的顺序效应核酸性质　　　 指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的一种逆转过程 热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“ 退火”（annealing） DNA的复性不仅受温度影响，还受DNA自身特性等其它因素的影响 * DNA体外扩增DNA的复性核酸性质核酸性质分子杂交：(hybridization)　不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，就可以完成复性应用：基因芯片DNA分离纯化分离纯化核酸性质က 1、真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1 mol/L NaCl ）， 但不溶于低盐溶液（0.14 mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNPက 2、DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。

还可用氯仿异戊醇去除蛋白质က 3、水相中的DNA可被0.3 M NaAC-70%乙醇沉淀核酸性质RNA的制备RNase 的灭活：က 玻璃器皿：140-200 ℃，8小时；က 塑料器皿：0.1% DEPC，37 ℃ ，过夜က 提取液（TRIzon)：盐酸胍或异硫氰酸胍က 反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂琼脂糖电泳琼脂糖电泳用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广影响迁移率的因素：① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比② 凝胶浓度③ DNA的构象，超螺旋最快，环型其次，线型最慢④ 电压，不大于5V/cm染色：0.5 ug/ml EBRNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛核酸性质下一章原核与真核生物的染色体结构。