第六章-色氨酸（trp）操纵子3.ppt

色氨酸（色氨酸（trp））操纵子操纵子l lac 和和ara操纵子是编码操纵子是编码分解代谢分解代谢途径酶系的操纵子，途径酶系的操纵子，负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操负责碳源（例如乳糖和阿拉伯糖等）的分解利用，这些操纵子的表达受相应碳源的诱导纵子的表达受相应碳源的诱导l 在细菌中还有负责一些物质在细菌中还有负责一些物质合成代谢合成代谢的操纵子，例如色的操纵子，例如色氨酸操纵子（氨酸操纵子（tryptophan operon,trp operon））就是负责就是负责色氨酸合成的操纵子色氨酸合成的操纵子trp操纵子是由一个启动子和一个操操纵子是由一个启动子和一个操纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合纵基因区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合成需要的成需要的5种蛋白的多顺反子种蛋白的多顺反子mRNA的表达l 由由于于trp体体系系参参与与生生物物合合成成而而不不是是降降解解，，它它不不受受葡葡萄萄糖或糖或cAMP-CRP的调控l 色色氨氨酸酸的的合合成成主主要要分分5步步完完成成，，有有7个个基基因因参参与与整整个个合合成成过过程程。

trpE和和trpG编编码码邻邻氨氨基基苯苯甲甲酸酸合合酶酶，，trpD编编码码邻邻氨氨基基苯苯甲甲酸酸磷磷酸酸核核糖糖转转移移酶酶，，trpF编编码码异异构构酶酶，，trpC编编码码吲吲哚哚甘甘油油磷磷酸酸合合酶酶，，trpA和和trpB则则分分别别编编码码色色氨氨酸酸合酶的合酶的α和和β亚基l trpEtrpE基因是第一个被翻译基因是第一个被翻译的基因，和的基因，和trpEtrpE紧邻的是紧邻的是启启动子区和操纵区动子区和操纵区另外，前导区和弱化子区分别定名为前导区和弱化子区分别定名为trpLtrpL和和trpatrpa（（不是不是trpAtrpA）l trp trp操纵子中产生阻遏物的基因是操纵子中产生阻遏物的基因是trpRtrpR，，该基因距该基因距trptrp基因簇很远后者位于大肠杆菌染色体图上基因簇很远后者位于大肠杆菌染色体图上2525分钟处，而分钟处，而前者则位于前者则位于9090分钟处在位于分钟处在位于6565分钟处还有一个分钟处还有一个trpStrpS（（色色氨酸氨酸tRNAtRNA合成酶），它与携带有色氨酸的合成酶），它与携带有色氨酸的tRNAtRNATrpTrp共同参与共同参与trptrp操纵子的调控作用。

操纵子的调控作用  弱化子弱化子 l 在在trp mRNA 5' 端端trpE基因的起始密码前有一个长基因的起始密码前有一个长162bp的的mRNA片段被称为前导区，其中片段被称为前导区，其中123～～150位碱基序列如果位碱基序列如果缺失，缺失，trp基因表达可提高基因表达可提高6-10倍，而且无论是在阻遏细胞内倍，而且无论是在阻遏细胞内还是在永久性突变的细胞内都是这样当还是在永久性突变的细胞内都是这样当mRNA合成起始以合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有止，产生一个仅有140个核苷酸的个核苷酸的RNA分子，终止分子，终止trp基因转基因转录，这就是录，这就是123～～150区序列缺失会提高区序列缺失会提高trp基因表达的原因基因表达的原因因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，因为转录终止发生在这一区域，并且这种终止是被调节的，这个区域就被称为弱化子这个区域就被称为弱化子 l研研究究引引起起终终止止的的mRNA碱碱基基序序列列，发发现现该该区区mRNA通通过过自自我我配配对对可可以以形形成成茎茎-环环结构，有典型的终止子特点。

结构，有典型的终止子特点前前 导导 肽肽l实验表明衰减作用需要负载实验表明衰减作用需要负载tRNATrp参与，参与，这意味着前导序列的某些部分被翻译了这意味着前导序列的某些部分被翻译了分析前导序列发现，它包括起始密码子分析前导序列发现，它包括起始密码子AUG和终止密码子和终止密码子UGA；；如果翻译起始如果翻译起始于于AUG，，应该产生一个含有应该产生一个含有14个氨基酸个氨基酸的多肽这个假设的多肽（还未实际观的多肽这个假设的多肽（还未实际观察到）被称为前导肽察到）被称为前导肽 l前前导导序序列列具具有有一一个个非非常常有有意意义义的的特特点点，，在在其其第第10和和第第11位位上上有有相相邻邻的的两两个个色色氨氨酸酸密密码码子子这这一一点点很很重重要要，，因因为为组组氨氨酸酸操操纵纵子子中中，，也也具具有有弱弱化化子子，，也也具具有有一一个个类类似似的的能能编编码码前前导导肽肽的的碱碱基基序序列列，，此此序序列列中中含含有有7个个相相邻邻的的组组氨氨酸酸密密码码子子苯苯丙丙氨氨酸酸操操纵纵子子中中同同样样存存在在弱弱化化子子结结构构，，其其前前导导序序列列中中也也有有7个个苯苯丙丙氨氨酸酸密密码码子子。

这这些些密密码码子子参参与与了了trp及及其其他他操操纵纵子子中中的的转转录录弱化机制弱化机制mRNA前导区的序列分析前导区的序列分析 ltrp前前导导区区的的碱碱基基序序列列已已经经全全部部测测定定，，引引人人注注目目的的是是其其中中4个个分分别别以以1、、2、、3和和4表表示示的的片片段段能能以以两两种种不不同同的的方方式式进进行行碱碱基基配配对对（（图图6-22）），，有有时时以以1-2和和3-4配配对对，，有有时时只只以以2-3方方式式互互补补配配对对RNaseT1降降解解实实验验（（此此酶酶不不能能水水解解配配对对的的RNA））表表明明，，纯纯化化的的trp前前导导序序列列中中确确有有1-2和和3-4的的配配对对方方式式，，由由此此定定位位的的3-4配配对对区区正正好好位位于于终终止止密密码码子子的的识识别别区区，，当当这这个个区区域域发发生生破破坏坏自自我我配对的碱基突变时有利于转录的继续进行配对的碱基突变时有利于转录的继续进行转录弱化作用转录弱化作用 l转转录录的的弱弱化化理理论论认认为为mRNA转转录录的的终终止止是是通通过过前前导导肽肽基基因因的的翻翻译译来来调调节节的的。

因因为为在在前前导导肽肽基基因因中中有有两两个个相相邻邻的的色色氨氨酸酸密密码码子子，，所所以以这这个个前前导导肽肽的的翻翻译译必必定对定对tRNATrp的浓度敏感的浓度敏感l当当培培养养基基中中色色氨氨酸酸的的浓浓度度很很低低时时，，负负载载有有色色氨氨酸酸的的tRNATrp也也就就少少，，这这样样翻翻译译通通过过两两个个相相邻邻色色氨氨酸酸密密码码子子的的速速度度就就会会很很慢慢，，当当4区区被被转转录录完完成成时时，，核核糖糖体体才才进进行行到到1区区（（或或停停留留在在两两个个相相邻邻的的trp密密码码子子处处）），，这这时时的的前前导导区区结结构构是是2-3配配对对，，不不形形成成3-4配配对对的的终终止止结结构构，，所所以以转转录录可可继继续续进进行行，，直直到到将将trp操操纵纵子中的结构基因全部转录子中的结构基因全部转录l而而当当培培养养基基中中色色氨氨酸酸浓浓度度高高时时，，核核糖糖体体可可顺顺利利通通过过两两个个相相邻邻的的色色氨氨酸酸密密码码子子，，在在4区区被被转转录录之之前前，，核核糖糖体体就就到到达达2区区，，这这样样使使2-3不不能能配配对对，，3-4区区可可以以自自由由配配对对形形成成茎茎-环环状状终终止止子子结结构构，，转转录录停停止止，，trp操操纵纵子子中中的的结结构构基基因因被被关关闭闭而而不不再再合合成成色色氨氨酸酸（（图图6-24））。

所所以以，，弱弱化化子子对对RNA聚聚合合酶酶的的影影响响依依赖赖于于前前导导肽肽翻翻译译中中核核糖糖体体所处的所处的位置The trp operon is negatively regulated by the Trp repressorTrp repressor binds its target DNA sequence only when it itself is bound by its co-repressor, tryptophan.The trp operator is a palindromicDNA sequenceltrp操纵子转录的调控是通过操纵子转录的调控是通过Trp阻遏物阻遏物实现的，它结实现的，它结合于合于trp操纵基因序列操纵基因序列 ，但，但Trp阻遏物的阻遏物的DNA结合活结合活性直接受色氨酸调控，色氨酸结合性直接受色氨酸调控，色氨酸结合Trp阻遏物，并起阻遏物，并起着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）着一个效应分子的作用（也称之辅阻遏物）l在有在有高浓度色氨酸高浓度色氨酸存在时，存在时，Trp阻遏物阻遏物-色氨酸复合色氨酸复合物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于物形成一个同源二聚体，并且紧密结合于trp操纵基操纵基因序列，因此可以阻止转录。

然而当因序列，因此可以阻止转录然而当色氨酸水平低色氨酸水平低时，缺少色氨酸的时，缺少色氨酸的Trp阻遏物以一种非活性形式存在，阻遏物以一种非活性形式存在，不能结合不能结合DNA在这样的条件下，在这样的条件下，trp操纵子被操纵子被RNA聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活聚合酶转录，同时色氨酸生物合成途径被激活ltrp操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用操纵子的另一种转录调控是称之衰减作用（（attenuation））的调控机制，这是一种将翻译与的调控机制，这是一种将翻译与转录联系在一起的新的转录调控形式细胞内转录联系在一起的新的转录调控形式细胞内Trp-tRNATrp浓度决定核糖体是否停留在浓度决定核糖体是否停留在trp mRNA中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码中的前导序列内的两个连续的色氨酸密码子处当色氨酸水平高和子处当色氨酸水平高和Trp-tRNATrp可利用时，可利用时，起转录终止作用的发卡环结构（由区起转录终止作用的发卡环结构（由区3和区和区4之间）之间）形成形成，，RNA聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处聚合酶刚好在一个聚尿嘧啶的下游处脱离脱离DNA模板，转录终止。

模板，转录终止l当由于细胞内色氨酸有限，当由于细胞内色氨酸有限，Trp-tRNATrp水平水平低时，核糖体就停留在低时，核糖体就停留在RNA中连续的一对色氨中连续的一对色氨酸密码子处核糖体这一瞬间的停留给出时间酸密码子处核糖体这一瞬间的停留给出时间使得一种替换的发卡结构在新的使得一种替换的发卡结构在新的RNA中（由区中（由区2和区和区3之间）形成，是一种抗终止的之间）形成，是一种抗终止的RNA结构，结构，它破坏了转录终止信号，使得它破坏了转录终止信号，使得RNA聚合酶能够聚合酶能够继续沿着继续沿着DNA模板滑动完成转录模板滑动完成转录　　　　The trp operonP = promoterT = terminatorO = operatortrpRtrpAP OPTTPolycistronic mRNA (encodes 5 proteins)mRNATrpR (repressor)5 separate proteins that were synthesized from one mRNAtrpBtrpCtrpDtrpEAttenuatorTrpRAttenuation in the trp operonEffectively adds a fine tuning to the regulation of the trp operon.Several key points:1.Transcription & translation are tightly coupled in bacteria (attenuation requires this).2.Synthesis of a leader sequence rich in Trp influences whether transcription of the trp operon is complete.3.If [Trp] is adequate transcription is terminated before the trp operon.4.If [Trp] is inadequate transcription is completed.5.Termination of transcription is determined by leader mRNA sequence.Attenuation – a transcriptional form of control mRNA leader sequenceAttenuator110140trpELeader polypeptide14 aa with 2 Trp aa1162Typical stem loopof Termination siteAttenuation12344231mRNATrp codonsmRNA sections1base pairs with 23base pairs with 44ONLY 3 + 4 generate5the termination siteAttenuation – Inadequate [Trp]1234mRNATrp codons2 314Ribosome stalls due to low [Trp]This large stem loop of 2 + 3 does NOT act as a terminator. Transcription continues!!RNA polymeraseAttenuation – Adequate [Trp]1234431Ribosome moves Rapidly along mRNAmRNA sections3base pairs with 4 to form a termination site, such that RNApolymeraseprematurely falls off themRNA and aborts furthertranscription. mRNAlAttenuation works by have the RNA polymerase stop (terminate) before the transcription of the structural genes, but AFTER it has already started to make an RNA.l The key is the region of the operon called trpL (see the figures above).The trp operon of E. coliIn tryptophan-poor mediumIn tryptophan-rich mediumOperon SummarylWe have considered in detail three operons: the lac operon, the ara operon, and the trp operon. The first two are operons concerned with the control of catabolic processes (utilization of energy substrates) while the third is concerned with anabolic processes (synthesis of a molecule the cell needs). lAll three share negative control features, using repressor proteins binding to operators to place the operon in the "off" state. The first two have positive control features that increase transcription in response to low glucose (CAP-cAMP binding to the CAP site). This is not the case for the tryptophan operon. The tryptophan operon, however, has the additional negative control feature of attenuation. These features are summarized in the following table:consensusTATA (Pribnow) boxE. coli Promoters Allosteric EffectorsBinding can also be required for binding of repressor (e.g. Trp) or can block an activator.Genomic Organization of the Trp Operon The Trp Operon Note that the order of the genes follows the order of the biosynthetic pathway!!Control of Gene Expression in the Trp Operon1)The enzyme catalyzing the first step in the pathway is inhibited by Trp (feedback control).2)In the presence of Trp, a repressor protein binds to an operator upstream of the Trp operon and shuts off transcription3)Attenuation. There is a 160 base pair region in the Trp mRNA that causes transcription to terminate prematurely if Trp is present. Feedback Control Transcriptional ControlAttenuation ControlAttenuation ControlHigh Trp LevelsRibosome proceedsLoop 3/4 forms Transcription terminatesLow Trp LevelsRibosome stallsLoop 2/3 formsTranscription continuesTrp Operon Controlled by AttenuationtrpR P O 1 2 3 4 trpE trpD trp C trp B trpAattenuatorLeader•attenuation can form under certain conditions•base-pairing can occur between1 - 2 2 - 3 3 - 4Attenuation58High levels of Tryptophan in Cell•transcription & translation occur simultaneously in Prokaryotes•leader transcript (1) has 2 trp codons (UGGUGG)•ribosomes moves fast along transcript•stem-loop 3 - 4 forms, poly Us after•early termination of transcription, translation stops (only leader peptide forms - has no function)59Low Levels of Tryptophan in Cell•ribosome stalls at UGGUGG in leader transcript (1)•stem-loop 2 - 3 forms, no poly U after•transcription continues60Low Levels of other Amino Acids•ribosome stalls way early•stem-loops 1-2 & 3-4 form, poly U after•early termination of transcription61The Trp Operon:When Tryptophan Is PresentSTOPRight therePolymeraseTrpTrpRepressorRepressorRepressorPromo.trpDtrpBLead.OperatortrpAtrpCtrpEAten.RNAPol.FoiledAgain!Repressor mRNAHey man, I’m constitutive3’5’5’3’Transcription And Translation In ProkaryotesRibosomeRibosome5’mRNARNAPol. Met-Lys-Ala-Ile-Phe-Val-AAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACA-AUG-AAA-GCA-AUU-UUC-GUA-Leu-Lys-Gly-Trp-Trp-Arg-Thr-Ser-STOPCUG-AAA-GGU-UGG-UGG-CGC-ACU-UCC-UGA-AACGGGCAGUGUAUUCACCAUGCGUAAAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUAAUGAGCGGGCUUUU Met-Gln-Thr-Gln-Lys-ProUUUU-GAACAAAAUUAGAGAAUAACA-AUG-CAA-ACA-CAA-AAA-CCG trpE . . .TerminatorThe Trp Leader and Attenuator4123The mRNA Sequence Can Fold In Two Ways4123Terminatorharipin41233’5’5’3’The Attenuator When Starved For Tryptophan4123RNAPol.RibosomeHelp,I needTryptophan3’5’5’3’The Attenuator When Tryptophan Is Present4123RNAPol.RibosomeRNAPol.。