无创产前技术.pptx

无创产前胎儿DNA检测 技术简介,唐氏综合征,47,XY,+21,21-三体综合征，又称先天愚型或Down综合征，是小儿最为常见的常染色体畸变疾病我国活产婴儿中21-三体综合征的发生率约为1/600～1/800，男女之比为3︰2，60%的患儿在胎儿早期即夭折流产传统产前诊断技术,无创产前诊断方法,游离胎儿DNA,胎儿细胞,游离胎儿RNA,孕妇外周血,胎儿细胞（fetal cell）,种类 滋养层细胞、胎儿有核红细胞、胎儿淋巴细胞、胎儿粒细胞 特点 包含完整的胎儿基因组可反映胎儿全部遗传信息 数目少，限制其应用于无创产前诊断,游离胎儿DNA Cell-free fetal(cff) DNA,Dennis Lo 卢煜明,特点： 1 含量是孕妇血液中胎儿细胞 DNA的970倍 2 含量有一定的变化规律，妊 娠第5周开始可以检测出胎儿 游离DNA，随着孕周增加而 增加，存在个体差异 3 分娩后短时间内消失，平均 半衰期为16.3min（4-30min）， 2h后没法检出ChrN: 100 Chr21:100,理论模型,正常胎儿,21三体胎儿,Description of the contents,1000 基因等分 /ml （含 50等份的胎儿基因 ; 950 等份的母亲基因）,ChrN: 1900 Chr21:1900,ChrN: 100 Chr21:150,母亲,,,统计结果:T21正常胎儿,血浆,技术流程,医院,血样采集,,,,,,,,,血样寄送包装,技术流程,,医院,4℃，16000g,10min,残留细胞,,取上清,样 品 处 理,两步法分离血浆：,,-80保存,在样品制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格品： (1) 血浆分离后存在明显的溶血； (2) 分离后血浆体积未达到最低要求(要求大于1.2ml)； (3) 血浆全部用于DNA提取后总量未达建库最低要求(30ng)； (4) DNA提取过程中，阴性对照可以检测到浓度。

样 品 处 理,DNA提取,使用微量样品基因组提取试剂盒(天根，DP316)进行血浆游离DNA提取,技术流程,,末端修复和加“A”,接头连接,T,,,,,,,,DNA insert,+,,PCR,P5,P7,Index,公用P1,Index PCR primer,P7,P5,PCR扩增,,,2100检测片段大小,文库质控,电泳结果,在文库制备过程中，具有以下任意一条不合格的，判定为不合格文库： (1) 电泳检测后发现接头未连接； (2) 电泳检测或2100检测后发现存在接头污染； (3) 2100检测后发现文库片段大小不合格，文库主峰大小为290bp左右，次峰大小为450bp左右； (4) 定量检测后，发现文库的浓度过低(浓度低于30ng/ul),文库不合格标准,技术流程,,将被打断成几百个碱基（或更短），并在两个末端加上接头(adapter)的基因片段按一定浓度进行稀释 将基因片段固定在芯片(Flow Cell)上由于芯片表面连接有一层单链引物(Primer)，经处理后的碱基片段与芯片上的引物进行互补连接，被“固定”在芯片上 引物扩增，以样品为亲本链，使芯片引物延长形成复制链Cluster Generation,碱基片段杂交,剩下的复制链其一端“固定”在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，被“固定”住，形成“桥”(bridge) 。

形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在芯片表面进行扩增，形成双链 双链经变性成单链，再次形成桥，并作为下一轮扩增的模板继续扩增反应 反复若干轮扩增，每个单分子得到了大量扩增，成为单克隆“DNA簇群”diol,,,,diol,,,,,,,1st cycle 变性,碱基片段扩增成簇,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Cluster 扩增完成,,OH,,diol,,,,diol,OH,,,,First base incorporated,Cycle 1: Add sequencing reagents,Detect Signal,Cleave Terminator and Dye,Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat,,边合成边测序原理,可逆阻断技术,Base Calling,T T T T T T T G T …,T G C T A C G A T …,HiSeq 2500 概况,PE,SBS A,SBS B,注射泵,,,试剂舱,光学控件,,Flow cell 舱盖,,鼠标键盘,,,,,试剂舱与样品舱,PE,试剂吸管把手 2个样品孔，同时上机2个文库 3个试剂架 2个 SBS 架 1 PE 架,Raising reagent rack sippers,PE,SBS A,SBS B,HiSeq 2500 试剂,测序试剂 安装约15 minutes 每次使用需更换试剂瓶盖 试剂舱恒温,Flow Cell 平台,Flow cells 用真空吸附 LED 显示真空吸附FC的情况,把手,Gasket,,,,,,面积更大, 双边面设计(8lane) 增加了5倍面积 保留 8 lane 设计 25mm 宽 X 75mm 长 Lanes 1.7 mm 宽 只适用于 cBot,Flow Cell 的设计,,双面使用,更快 的成像 线扫描 Time Delay Integration (TDI) 成像系统 对flow cell的两个表面clusters进行扫描 更大的测序通量输出,,成像,4 CCD cameras 4个碱基图像同时捕获 先扫描上表面 (all 4 colors) 再扫描下表面 (all 4 colors),A,T,C,G,,,Flow Cell 线扫描,Swath 把一个lane的一半定义为一个 swath Cameras operate in TDI – 不间断的输出图像,,swaths,,,y,,,,Flow Cell Swath/Tile,,Flow Cell,Swath,Tile,HiSeq Control Software (HCS) 把1个 swath 划分为 8 个部分 (tiles),,,,,,,,,,,,HiSeq Control Software (HCS) 操作界面,更加简单的操作 Step-by-step run set up,人性化的 recipe,实时监控 试剂跟踪,帮助菜单,HiSeq Control Software (HCS),HCS 应用于整个RUN 的流程: 建立RUN的信息及参数 进行测序 对整个RUN进行监控 对一些操作步骤进行提醒 (e.g.,安装试剂,FC, priming, wash),测序准备工作,建立测序信息,进行测序(run),HCS操作界面,,,First Base 报告,若在操作界面上选取了Confirm First Base,就会弹出First Base报告进行这个RUN 的初步评判,,,Option selected during Run Configuration,,HiSeq 2500 HCS软件,HCS软件初步数据分析结果,,,,,HiSeq 2500HCS软件,一个RUN的Images Thumbnail 概况,,,,,,,,HiSeq 2500 数据分析 A Simple, Familiar Workflow,,images,intensities,base calling,alignment,biologically meaningful results,基因信息分析,通过alignment(比对), 获得所测得的每条序列的位置信息. 依据这些位置信息,我们可以把每条序列定位到相应的染色体上. 统计所有的序列分布情况,我们就可以获得分布在每条染色体上的序列条数. T21样品分布在21号染色体上的序列条数比正常eupoid（二倍体）的样品的多. 通过统计学上的检验,我们可以依据多的量检出T21或其它染色体非整倍性变异.,原始数据质量标准,下机数据质控 格式转化后，统计每个reads长度，将大于50bp长度的reads截短至50bp，将不足50bp长度的reads舍去。

其后，对每一个样品的reads数据进行质控，统计每个样本的数据量，将原始数据量小于300M的样本标记同时分析reads的质量值和GC值是否有偏差，并画出图谱 过滤数据质控 过滤原始数据后，若舍去数据在10%以上，通常表明下机数据质量偏差此时，可再次对每一个样品的clean reads进行质控，画出reads的质量值和GC图谱，分析clean reads的质量值是否有所提高，GC是否趋向稳定等等若过滤后这些值依然偏差，则可考虑数据重测 比对数据质控 数据比对后，统计所有完全比对到基因组上唯一位置的reads数所占clean reads的比率，若比值小于50%，需分析原因，必要时考虑数据重测 Z值结果质控 对所有染色体的Z值进行统计，若Z值总和大于50并且单个染色体最大Z值小于6，标记为“Unqualified sample suspicion”分析原因，必要时考虑数据重测谢谢！,。