Tau蛋白的分析方法研究进展.docx

    Tau蛋白的分析方法研究进展    李淋雨 王晓英摘 要 Tau蛋白（简称Tau）是一种参与神经系统发育的微管相关蛋白Tau可经历构象改变、异常mRNA剪接等，从微管解离，经系列翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），自身形成病理性聚集，进而造成神经退行性病变，最终形成Tau病研究Tau的病理过程，分析评估其PTM及定量检测其浓度变化，对Tau病的早期诊断、跟踪、预防和治疗具有重要意义本文对目前Tau的常规分析方法进行了概述和比较，重点阐述光学、电化学生物传感方法的最新研究进展与相关应用，对未来发展方向进行了展望，为Tau蛋白的深入研究与应用提供参考关键词 Tau蛋白;Tau病;生物传感器;翻译后修饰;评述1 引 言Tau蛋白（简称Tau）是一种参与神经系统发育的微管相关蛋白，富集于神经元轴突周围，与微管蛋白结合形成微管，可稳定微管并促进轴突运输[1]Tau经历构象改变、异常mRNA剪接等，从微管解离，经系列翻译后修饰（Post-translational modification，PTM），自身形成病理性聚集，进而造成神经退行性病变，最终形成Tau病[2，3]。

在进行性核上性麻痹、皮质基底节变性、额颞痴呆等原发性Tau病以及C型Niemann-Pick病、阿尔兹海默病（Alzheimer disease，AD）等继发性病中均可检测到Tau的异常修飾、含量变化及病理沉积[4，5]其中，由Tau异常聚集形成的神经元纤维缠结（Neurofibrillary tangle，NFT）是AD的病理标志之一[6]研究Tau的病理过程，分析评估其PTM及定量检测其浓度变化，对Tau病的早期诊断、跟踪、预防和治疗具有重要意义目前，已有少量关于Tau的神经成像技术的评述与报道如Villemagne等[7]研究了示踪剂的选择，Hall等[8]研究了Tau与认知障碍的相关性，Hammes等[9]研究了Tau在神经退行性疾病中的病理性聚集但是，并没有全面反映近年来针对Tau的病理过程、分析检测方法的最新研究进展基于Tau结构的特殊性、PTM与聚集过程的复杂性等，对Tau的分析方法的灵敏度、高效性提出了更高的要求本文对Tau的常规分析方法进行了概述和比较，重点阐述了光学、电化学生物传感方法的最新研究进展与应用，对其未来发展方向进行了展望2 Tau的结构与形态2.1 结构Tau由位于17染色体长臂的基因编码，含16个外显子，长352～441个氨基酸，分子量为45～65 kDa。

Tau可分为N末端投射功能区（N端）、脯氨酸富集区、微管结合区（Microtubule-binding domain，MBD）和C末端功能区（C端）其中，N端长度不确定，可插入由外显子2（E2）、3（E3）控制的额外片段脯氨酸富集区含大量磷酸化位点，而C端提供了部分磷酸化位点[10，11]重复序列（R1-R4）位于MBD，其微管结合力最强并促进微管自聚集[12，13]，同时也是双螺旋细丝（Paired helical filament，PHF）的核心结构人类Tau因mRNA剪辑方式不同，表达出6种同工异构体，即Tau352、381、383、410、412和441，其差异在于C端是否存在3或4个重复序列，N端是否存在有1或2个插入物[12]外显子10（E10）编码R2片段，能保留E10且具有4个重复序列的Tau统称为4RTau;不保留E10且只有3个重复序列的Tau统称为3RTau[14]成年人脑内3RTau、4RTau表达量相当，而成年老鼠只表达4RTau[15]2.2 形态Tau单体结构类似“回形针”，如图1A所示Tau可经历构象改变、异常mRNA剪接等，脱离微管致微管解聚，并从惰性单体转变为可聚集的“种子”形式（病理性Tau）。

病理性Tau经C端-MBD，N端-C端相互作用，折叠形成Tau的低聚物[16]，如图1B所示病理性Tau以朊病毒样形式沿突触在神经元间传播，形成的低聚物经系列PTM后，进一步在神经元中聚集，形成PHF [17]，如图1C所示3 Tau的PTMTau的PTM种类包括磷酸化（Phosphorylation）、糖基化（Glycation）、硝化（Nitration）、泛素化（Ubiquitination）、乙酰化（Acetylation）、甲基化（Methylation）和脯氨酰异构化（Prolyl-isomerization）等[18]PTM可影响Tau的活性、结构及与其它蛋白质的相互作用其中，磷酸化作为关键致病步骤而受到广泛关注[19]3.1 磷酸化磷酸化是在蛋白激酶（Protein kinases，PK）作用下将ATP的磷酸基团转移到Tau氨基酸残基上，形成磷酸化Tau（P-Tau）的过程PK包括脯氨酸定向PK、非脯氨酸定向PK和酪氨酸蛋白PK [20，21]去磷酸化是经蛋白磷酸酶（Protein phosphatase，PP）去除P-Tau氨基酸残基上的磷酸基团的过程，PP主要包括PP1、PP2A、PP2B、PP2C、PP3和PP5[22]。

其中，PP2A的去磷酸化效应最强，在AD患者脑中的表达和活性均降低[23]冈田酸（OA）可使PP1、PP2A失活引起氧化应激损伤，进而诱导P-Tau[24]Tau含85个磷酸化位点，其中包括45个丝氨酸（Ser）、35个苏氨酸（Thr）和5个酪氨酸（Tyr）残基部分磷酸化位点也可发生去磷酸化，但其发生反应所需PK、PP的种类与数量不同 [25，26]健康神经元中，磷酸化与去磷酸化保持动态平衡当PP、PK调控失衡，磷酸化水平提高至正常的2～3倍，即引起过度磷酸化[27]，可使Tau因失去生物活性而不可溶、抗降解且易聚集，丧失稳定微管的正常功能，并干扰和分解细胞骨架，最终影响轴突运输机制，并促成突触功能障碍和神经变性[28，29]此外，β-淀粉样蛋白（Amyloid β-protein，Aβ）、异常糖基化的诱导也可促成过度磷酸化[30，31]3.2 其它PTM糖基化经非酶促反应在氨基酸上修饰糖基，可使Tau降解受阻而发生聚集 [32]硝化经硝基（NO2）共价修饰Tyr残基[33]，抑制Tau结合与稳定微管的能力，使其更易聚集 [34]人体外硝化位点包括Tyr18、Tyr29、Tyr197和Tyr394，但Tyr29和Tyr197硝化更易引起Tau聚集[35]。

泛素化是在系列酶的作用下，将泛素修飾在C端MBD的赖氨酸（Lys）残基上，并随着PHF的增加而增多[36]在AD患者PHF、脑脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）中，泛素化Tau含量较高[37]乙酰化是经组蛋白乙酰转移酶在Lys残基修饰乙酰基，可调节细胞功能和能量代谢，并诱导P-Tau[38]甲基化是通过在Lys和精氨酸残基上引入甲基，可影响Tau与微管结合及Tau同工异构体间的相互作用[39]甲基化位点多分布于MBD，可促进磷酸化，并与乙酰化、泛素化等存在竞争作用[40]脯氨酰异构化于Thr231重排二硫键，使Tau从顺式构象转变为反式构象[41]反式构象的Tau不与微管结合，经聚集形成PHF[42];肽基-脯氨酰顺/反异构酶可使其转变为顺式构象，恢复与微管结合力，并促进PP2A去磷酸化[43]目前，磷酸化作为调控AD的关键步骤而受到广泛关注正常情况下，磷酸化和去磷酸化分别负、正调控Tau与微管的亲和力，且二者保持动态平衡[44]病理情况下，Tau过度磷酸化形成P-Tau，因与微管结合力减小而脱离微管，致微管解聚、神经元发生变性和死亡，最终诱导AD[45];同时，易自我聚集的P-Tau在某些PTM影响下，经历形态改变，发生聚集，并最终形成NFT[20]，上述两种途径同时发生则进一步加快了AD的病理进程（图2）。

4 Tau的常规分析方法Tau的常规分析方法主要包括神经成像、免疫检测和质谱（Mass spectrometry，MS）等技术其中，神经成像技术可用于研究Tau的病理成像，免疫检测方法用于血浆或CSF中Tau或P-Tau的分析，质谱技术则主要用于研究Tau的PTM4.1 神经成像神经成像泛指能够直接或间接对脑部的功能、结构和药理学特性进行成像的技术，可捕捉脑部Tau的形态改变，利于临床研究和诊断，包括正电子发射断层扫描（Positron emission computed tomography，PET）、单光子发射计算机化断层显像（Single-photon emission computed tomography，SPECT）和磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）等PET经放射性示踪剂标记抗体，对细胞表面抗原进行扫描显像，为无创方法[46]Tau与示踪剂标记的抗体特异性结合后，经PET显示分布情况，示踪剂保留的形貌与预期病理阶段对应，且Tau的沉积模式与代谢减退之间存在密切关系[47]目前，18F-AV-T807和18F-AV-1451是Tau常用的示踪剂[48，49]，但因示踪剂的半衰期较短（18F：110 min），使PET检测Tau的应用受限[50]。

SPECT是以单光子放射性核素标记药物作为显像剂，通过扫描病人体内放射性标记药物发射的γ射线的成像技术 苯基二苄基苯并噻唑（PDB）是常用药物，小鼠的生物分布实验表明，PDB衍生物在大脑中呈持续放射性水平，目前尚不适用于人体NFT成像[51]MRI经体外高频磁场对静磁场中的人体施加某特定频率的射频脉冲，激发人体内水和脂肪的氢质子而引起磁共振现象，并通过获得的电磁信号重建人体信息多参数MRI、高分辨率结构MRI等对评估Tau病理改变意义重大[52，53]4.2 免疫检测方法免疫检测基于抗原-抗体的特异性结合，包括酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、蛋白质印迹法（Western blot，WB）、基于纳米粒子的免疫聚合酶链式反应（Nanoparticles-immuno polymerase chain reaction，Nano-iPCR）和免疫磁减量（Immunomagnetic reduction，IMR）等ELISA是目前应用最广泛的方法之一Arai等[54]采用ELISA证明AD患者的CSF-Tau（（95.6±105.3） pg/mL） 显著高于正常人（（32.7±43.2）pg/mL），灵敏度为93.8%，特异性为75%，提示可经CSF-Tau预测AD。

Kohnken等[55]利用夹心ELISA测定AD患者CSF-P-Tau的截断值为10.1 ng/mL，灵敏度为85%，特异性为97%，总体准确度为91%与CSF-Tau相比，CSF-P-Tau因与AD进程高度相关而更受关注WB又称免疫印迹，是将蛋白质经凝胶电泳分离后，通过抗原-抗体的特异性结合完成检测WB操作简单，可直接对抗体进行荧光标记，广泛用于定量检测Tau和P-Tau[56]Rthlisberger等[57]采用WB获得AD患者唾液中P-Tau和总Tau的比值（P-Tau/T-Tau），与正常人相比（0.96），75%的AD患者P-Tau/T-Tau可升高至1.00，该方法灵敏度为73%，特异性为50%唾液与血浆、CSF相比，因无创、易得等优点广受关注但是，WB因敏感性和特异性不足，尚无法直接用于临床测试Nano-iPCR是经纳米粒子放大信号，结合免疫PCR检测的技术Stegurov等[58]采用Nano-iPCR定量检测Tau，经PCR板孔内的抗体捕获Tau形成抗原-抗体复合物后，结合金纳米粒子（AuNPs）标记的二抗，形成双抗夹心复合物，经免疫PCR检测Tau的检出限（Limit 。