《生物化学实验》教学课件—21-核酸的定量测定-定磷法.pptx

生物化学实验技术生物化学实验技术核酸的定量测定定磷法实验类型：实验类型：实验类型：实验类型： 验证性验证性验证性验证性教学时数：教学时数：教学时数：教学时数：3 3生物化学实验技术一、实验目的一、实验目的 掌握掌握定磷法测定核酸含量的原理与方法定磷法测定核酸含量的原理与方法生物化学实验技术二、实验二、实验原理原理 核酸核酸分子中含有一定比例的有机磷，一般分子中含有一定比例的有机磷，一般为为9.5%左右（左右（RNA中含磷量为中含磷量为9.0，DNA中中含磷量为含磷量为9.2），因此通过测得核酸中有机），因此通过测得核酸中有机磷的含量即可推算出核酸的量，即每测得磷的含量即可推算出核酸的量，即每测得1mg有机磷，就表示有有机磷，就表示有11mg的核酸用强酸使核的核酸用强酸使核酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸分子中的有机磷消化成为无机磷，使之与钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀）PO42- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ (NH4)3PO412 MoO36H2O + 6H2O生物化学实验技术 当当有还原剂存在时，有还原剂存在时，Mo6+被还原成被还原成Mo4+，此此4价钼再与试剂中的其他价钼再与试剂中的其他MoO42-结合成结合成Mo(MoO4)2或或Mo3O8，呈蓝色，称为钼蓝，呈蓝色，称为钼蓝。

钼钼蓝在蓝在660nm处有最大光吸收峰，在一定处有最大光吸收峰，在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可用比色法测定当使用抗坏血酸为还原剂时，用比色法测定当使用抗坏血酸为还原剂时，测定的最适范围为测定的最适范围为110微克无机磷微克无机磷生物化学实验技术 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量将总磷量即样品未经消化直接测得的含磷量将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量生物化学实验技术三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、仪器：分析天平、仪器：分析天平、容量瓶、容量瓶、台式离心机及台式离心机及离心管、凯氏离心管、凯氏烧瓶、烧瓶、恒温水浴锅、恒温水浴锅、200烘箱、烘箱、硬质玻璃试管、移液管、硬质玻璃试管、移液管、分光光度计。

分光光度计2、试剂、试剂：标准：标准磷磷溶液，定溶液，定磷磷试剂，沉淀剂，试剂，沉淀剂，5mol/L硫酸，硫酸，5%氨水生物化学实验技术四、实验内容四、实验内容1、 磷标准曲线的绘制磷标准曲线的绘制 取取试管试管6支，支，05依次编号按下表加入依次编号按下表加入各试剂各试剂 注意每加好一种试剂后应立即摇匀注意每加好一种试剂后应立即摇匀试试 剂剂012345标准磷溶液标准磷溶液/mL00.20.40.60.81.0定磷试剂定磷试剂/mL333333蒸馏水蒸馏水/mL32.82.62.42.22.0A660nm0生物化学实验技术 各各反应液加毕后，于反应液加毕后，于45水浴保温水浴保温10min，冷却，置分光光度计中分别测定在其波长，冷却，置分光光度计中分别测定在其波长660nm的光光吸收值（的光光吸收值（A660nm）以所得光）以所得光吸收值为纵坐标，以无机磷含量为横坐标，作吸收值为纵坐标，以无机磷含量为横坐标，作图，即得无机磷的标准曲线图图，即得无机磷的标准曲线图生物化学实验技术2、总磷的测定、总磷的测定 准确准确称取样品（粗核酸）称取样品（粗核酸）0.1g，用少量蒸馏水，用少量蒸馏水溶溶解，解，转移至转移至50mL容量瓶中，加水至容量瓶中，加水至刻度。

刻度 吸取上述吸取上述样液样液1.0mL，置于，置于50mL克氏烧瓶中，加入克氏烧瓶中，加入2.5mL 10mol/L硫酸，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通硫酸，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风厨内），在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完风厨内），在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完成成 冷却冷却，将消化液移入，将消化液移入100mL容量瓶中，用少量水容量瓶中，用少量水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加水至刻度，混匀后吸取至刻度，混匀后吸取3.0mL置于试管中，加定磷试剂置于试管中，加定磷试剂3.0mL，45水浴中保温水浴中保温10min，冷却测，冷却测A660nm生物化学实验技术3、无机磷的测定、无机磷的测定 吸取吸取样液（样液（2mg/mL）1.0mL，置于，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取3.0mL置试管中，加定磷试剂置试管中，加定磷试剂3.0mL，45水水浴中保温浴中保温10min，测，测A660nm 生物化学实验技术。