应用真核系统表达猪生长激素基因的研究.pdf

中山大学博士学位论文应用真核系统表达猪生长激素基因的研究姓名：欧阳菁申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：王珣章;龙綮新2003.6.6应用真核系统表达猪生长激素基因的研究欧阳菁导师：王殉章教授龙綮新教授专业：生物化学与分子生物学摘要生长激素( S o m a t o t r o p i n ) 是一种具有广泛生理功能的生长调节素．能影响几乎所有的组织类型和细胞，甚至包括免疫组织、脑组织及造血系统，其主要作用是刺激骨、软骨细胞的生长和分化，调节蛋白质、糖及脂肪的代谢猪生长激素( P o r c i n es o m a t o 仃o p i n ，p S T ) 是猪体内天然存在的一种能调节其正常生长和肌肉发育的主要激素之一．它不仅能促进葡萄糖的吸收、核酸与蛋白质的合成、脂肪的分解，同时还能增加矿物质的吸收与滞留给猪注射外源p S T 可显著提高生长速度和生长效率，减少饲料消耗和脂肪沉积以前，人们都是直接从猪的脑垂体中分离提取p S T 的，这使得p S T 的来源非常有限，从而导致价钱昂贵，不利于在农业生产中推广利用随着基因工程技术的飞速发展，成千上万的外源蛋白基因在各种微生物和组织培养细胞中得到了有效的重组表达。

1 9 8 3 年，S e e b u r g 等最先从猪脑垂体中分离提取了p S T 的m R N A ，并将扩增得到的e D N A 构建到原核表达载体，使p s T 基因在E ．c o i l 中进行表达之后，人们进行了大量类似的原核表达研究由于原核表达系统缺乏翻译后的加工修饰功能，且外源蛋白易形成包涵体．使得表达产物处于未折叠的状态．缺乏应有的生物活性因此，近年来，人们把p S T 基因的表达研究转移到了真核系统．如哺乳动物细胞和酵母本论文利用昆虫细胞和巴斯德毕赤酵母( P i c h i a p a s t o r i s ) 对p S T 基因的表达进行了研究首先，本研究利用既可高效表达外源基因又可形成多角体的杆状病毒表达载体p S X I V V I + X 3 ／4 构建了带有p S T 全长基因( p S T l 基因，含自身信号肽序列)的重组质粒p x 3 ／4 ．p S T l 将p X 3 ／4 ．p S T lD N A 与致死缺失型线性化B a c u l o G o l d T MA c M N P V ．O C C - D N A 共转染s f 9 细胞，通过同源重组构建出含p S T 全长基因的重组病毒A c M N P V ．p X 3 1 4 ．p S T l ．O C C + 。

S D S ．P A G E 和W e s t e r nb l o t 分析结果显示得到了分子量约为2 2k D 的融合蛋白，该r p S T 仅为胞内可溶蛋白，未能成功分泌到胞外为使昆虫细胞中的表达产物能够进行正确的加工和分泌，本研究继而采用带有强信号肽序列的杆状病毒表达载体p A c G P 6 7 一A ，使去除了自身信号肽序列的p S T 基因( p S T 2 基因) 与g p 6 7 信号肤基因在P №( 多角体启动予) 的控制下共同表达结果分泌表达的r p S T 占培养液上清总蛋白的3 ．6 1 ％，但仍不适于p S T的商业化生产最后，论文利用Pp a s t o r i s 以期获得能适于商业化生产的p S T 的高水平表达此，通过P C R 技术扩增出不带信号肽序列的p S T 2c D N A 片段( 约5 8 0 b p ) ，其组建成重组质粒p P I C Z 也A ．p S T 2 线性化的p P l C Z t ：t A ．p S T 2 用高压脉冲电流转化宿主菌Pp a s t o r i sX ．3 3 ，筛选转化子得到r p S T 分泌表达水平高的x ．3 3 ／p P I C Z t 埔．p S T 2 ／9 。

其培养液上清和细胞可溶蛋白中均有一条分子量约为2 2k Dp S T 特异反应带．且分泌的r p S T 比天然p S T 略大一点．胞内可溶r p S T 的迁移速率跟天然p S T 差不多线性化的p P I C Z 剖k ．p S T 2 再次电击转化x ．3 3 ／p P I C Z c t A ．p S T 2 ／9 ，得到可在含2 0 0 0I j t g ／m lZ e o c i n ⋯的Y P D S 板上存活且能分泌更多r p S T 的重组菌X - 3 3 ／p P I C Z o ．A —p S T 2 ／9 —7 分泌的r p S T 达9 5 6m g ／L ．且9 0 ％以上的r p S T 被成功分泌到培养液上清中根据对p S T 表达的优化条件及表达产物的纯化进行研究的结果．将重组菌X ．3 3 ／p P I C Z t z A ．p S T 2 ／9 ．7 用1 ．o ％的甲醇诱导表达9 6h 后的培养基上清用4 5 ％饱和度的( N H 4 ) 2 S 0 44 ℃沉淀过夜、沉淀重溶、s 印h a d e x “G - 2 5F i n e 脱盐及QS e p h a r o s e T MH i 曲P e r f o r m a n c e 阴离子交换层析后．r p S T 的纯度超过9 5 ％，回收率达7 1 ．4 ％。

M A L D I ．T O F - M S 测定分子量为2 1 7 7 1D a ，比预测的理论分子量2 1 8 6 0D a 小8 9D a 三批纯化后的样品的等电点测定的结果一致，显示为3 条带，l l其中中间1 条主带的口，在4 ．5 5 ．5 ．2 之间，但比预测的等电点( p l = 6 ．2 4 ) 和天然p S T 的( p l - - - ' 6 ) 略小胰蛋白酶水解的2 0 个肽段中检测出1 4 个，结合肽谱分析和分子量测定的结果，可推断r p S T 一级结构正确x ．3 3 ／p H C Z a A ．p S T 2 ／9 ．7 表达上清可明显促进大鼠N b 2 淋巴瘤细胞的增殖当r p S T 浓度9 1 2 ．81 t t g 时，促细胞增殖能力与r p S T 浓度呈正相关性纯化r p S T 的也对细胞增殖具有一定的促进作用，但效果不如x 一3 3 ／p P I C 7 _ - 』x A - p S T 2 ／9 ．7 的培养液上清对猪注射r p S T 初提纯样品的试验结果表明，每头猪的平均日采食量明显减少，随着注射总剂量和时间的增加，减少更明显，尤其是在第二个试验周期内( 第1 5 天～第2 8 天) 。

与对照组相比，试验组的平均饲料消耗减少了4 ．1 8 ％但注射r p S T 并没能使猪的日增重得到显著性提高，只是略有增加利用A N T H E P R O T 较件包和H o m o l o g ym o d e l i n g 法分别对r p S T 的二级结构和三级结构进行了预测，发现r p S T 的主要二级结构类型是a ．h e l i x 由于r p S T 与h G H 的氨基酸序列同源性大于6 0 ％，利用h G H 结构进行模建，得到了r p S T 的三维空间结构模型5 3 9 ％的氨基酸位于这4 个长螺旋内r p S T 中有四个半胱氨酸，分别为第5 3 、1 6 4 、1 8 1 、1 8 9 位氨基酸根据h ( 3 H 和b G H 的结构模型，推{ 冥4r p S T 的两对二硫键分别发生在5 3 C y s 和⋯C y s 、1 8 1 C y s 和哪c y s 问) 一，关键诃：猪生长激素；杆状病毒轰选羲体秉餐巴斯德毕赤酵母；芾喽；性质鉴定I I IS t u d i e so nt h eE x p r e s s i o no fP o r c i n eS o m a t o t r o p i nG e n ei nE u k a r y o t i cS y s t e m sS u p e r v i s e db yX u n z h a n gW a n g ，P r o f e s s o rQ i n g x i nL o n g ，P r o f e s s o rM a j o ri nB i o c h e m i s t r y ＆M o l e c u l a rB i o l o g yA b s t r a c tT h eg r o w t hh o r m o n e ．s o m a t o t r o p i n ，i sap r o t e i nh o r m o n eo fa b o u t1 9 0a m i n oa c i d st h a ti ss y n t h e s i z e da n ds e c r e t e db ys o m a t o t r o p h si nt h ea n t e r i o rp i t u i t a r yi nr e s p o n s et Ot h eh y p o t h a l a m i cp e p t i d e ，G H ·r e l e a s i n gf a c t o r ．S o m a t o t r o p h i ni sam a j o rp a r t i c i p a n ti nc o n t r o lo fs e v e r a lc o m p l e xp h y s i o l o g i cp r o c e s s e si n c l u d i n gg r o w t h ，m e t a b o l i s m ，p r o t e i ns y n t h e s i s ，a n dc e l lp r o l i f e r a t i o n ．P o r c i n es o m a t u U ' o p i n ( p S T ) i sn a t u r a l l yp r o d u c e di np i g s ，a n dt r e a t m e n to fg r o w i n gp i g sw i t he x o g e n o u sp S Ts i g n i f i c a n t l yi m p r o v e st h e i rg r o w t hr a t e ，c a r c a s sc o m p o s i t i o n ，a n dg r o w t he f f i c i e n c yw h i l er e d u c i n gf e e dc o n s u m p t i o na n df a td e p o s i t i o n ．H i s t o r i c a l l y ，p S Tw a sd e r i v e df r o mt h ep i t u i t a r yg l a n d so fs l a u g h t e r e dp i g s ，l i m i t i n gt h ea v a i l a b l eq u a n t i t i e sa n ds e u i n gt h ep r i c ec o r r e s p o n d i n g l yh i g h ．M o r er e c e n t l y ,r e c o m b i n a n tD N At e c h n o l o g yh a sa l l o w e de x p r e s s i o no fp S Ti nm i c r o o r g a n i s m sa n dc u l t u r e dc e l l s ．p S Te D N Ap r e p a r e du s i n go o l y ( A ) m R N。