人白介素12植物表达载体的构建.doc

1人白介素12 植物表达载体的构建【摘要】 　　目的： 构建人白介素 12(hIL 12) 基因的植物表达载体. 方法： 采用 PCR 技术从质粒 pCA13 hIL 12 中扩增 hIL 12基因，SmaI， SacI 分别酶切 hIL 12 基因和植物表达载体pBI121，回收，T4DNA 连接酶连接得到重组质粒pBI121 hIL 12，双酶切和 DNA 测序鉴定后，通过三亲杂交法将表达载体 pBI121 hIL 12 分别导入根癌农杆菌 EHA105 和GV3101，用 PCR 法进行鉴定. 结果： 双酶切及 DNA 序列测定证实 hIL 12 已插入到表达载体 pBI121 中，PCR 扩增表明构建的重组表达载体 pBI121 hIL 12 成功转入根癌农杆菌 EHA105 和GV3101 中. 结论： 成功构建了植物表达载体 pBI121 hIL 12，为进一步利用转基因植物生产 hIL 12 奠定了实验基础. 【关键词】 人白细胞介素 12 植物表达载体 载体构建 根瘤菌属0 引言人白细胞介素 12(hIL 12) 能促进自然杀伤细胞（ NK）和 T细胞的增殖、活化及细胞毒作用，诱导 γ 干扰素的产生，调节 Th0细胞向 Th1 细胞分化增殖，增强细胞免疫等多种生物学活性［1］ ，2在机体的抗肿瘤、抗病毒、抗过敏过程中发挥极其重要的作用［2］. 自然状态下, 体内 IL 12 含量低，获得较困难. 我们构建 hIL 12 基因的植物表达载体，为利用植物基因工程技术生产 hIL 12 基因进行前期准备工作.1 材料和方法1.1 材料大肠杆菌菌株 DH5α,含人 IL 12 的质粒pCA13 hIL 12 由遵义医学院生物化学与分子生物学实验室保存；植物表达载体 pBI121 由浙江大学馈赠；根癌农杆菌EHA105，GV3101 以及辅助质粒 pRK2013 由华南热带农业大学国家重点实验室馈赠. 限制性核酸内切酶（SmaI， SacI） ，T4DNA连接酶（美国 Promega 公司） ；高保真即用 PCR 扩增试剂盒、UNTQ 10 柱式 DNA 胶回收试剂盒（上海生工生物工程公司） ；化学试剂均为国产分析纯.1.2 方法1.2.1hIL 12 引物的设计上游引物参考 GenBank 中 cDNA 序列进行设计，由上海生工生物工程公司完成，即 5′ TCC CCC GGG CCA CCA TGG GTC ACC AGC A 3′，其中 CCC GGG 为 SmaI 酶切位点；下游引物 5′ A CCG GAG CTC TTA GGA AGC ATT CAG 3ATA G 3′，其中 GAG CTC 为 SacI 酶切位点.1.2.2PCR 扩增 hIL 12 基因在 0.2 mL Eppendorf 管中加入上、下游引物各 3 μL，模板 pCA13 hIL 12 1 μL，2×PCR Master 25 μL，补去离子水至 50 μL. 扩增条件为 94℃ 10 min，94℃ 1 min，64℃ 1 min，72℃ 2.5 min，30 个循环，72℃延伸 10 min. 扩增产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳进行分离，将 1600 bp 左右的目的片段回收纯化.1.2.3 重组质粒 pBI121 hIL 12 的构建和鉴定 PCR 产物纯化回收后与载体 pBI121 经限制性核酸内切酶（SmaI， SacI）双酶切，取回收的 PCR 产物和载体大片段以浓度比 3∶1，16℃连接过夜. 转化感受态 DH5α 细胞，涂布于 100 mg/L 卡那霉素抗性琼脂平板，挑选阳性克隆，碱裂解法小量提取重组质粒，作 SmaI，SacI 双酶切鉴定，并送上海生工生物工程公司进行测序鉴定［3］. 构建的重组载体见图 1，其中 hIL 12 由 P35，P40 两亚基的基因经 Linker序列连接得到.图 1 表达载体 pBI121  hIL 12 示意图1.2.4pBI121  hIL 12 转化根癌农杆菌采用三亲杂交法：受体菌、供体菌及辅助转移菌分别于 3 mL 含相应抗生素的 LB 培养基中培养4过夜（受体菌，28℃；其余两种 37℃过夜培养） ，按 1∶1∶1 的比例混合后，取 50 μL 涂布在无抗生素的 LB 平板上，28℃ ，过夜培养，待长出菌落后涂布相应的选择平板（含 50 mg/L 卡那霉素、100 mg/L 利福平、50 mg/L 链霉素） ，待长出后，挑单菌落重新在相应的选择平板上进行纯化，挑出纯化后的单个菌落在相应抗性 LB液体培养基中 28℃，过夜培养，用于鉴定 .1.2.5 转化农杆菌的 PCR 鉴定采用文献［ 4］的方法分别提取农杆菌（EHA105，GV3101）中的 mini Ti 质粒，用预先设计的引物进行 PCR 扩增鉴定，获得可用于遗传转化的农杆菌.2 结果2.1PCR 方法获取 hIL 12 基因片段以质粒 pCA13 hIL 12 为模板，运用 PCR 方法获得全长 hIL 12 基因（1613 bp，图 2）.2.2 重组质粒 pBI121 hIL 12 的鉴定经限制性内切酶SmaI，SacI 酶切后得到大小约 1600 bp 和 12800 bp 的大片段，表明 hIL 12 已经克隆到质粒 pBI121 中（图 3）. 质粒送上海生工生物工程公司进行全长测序鉴定，通过序列比对分析发现，目的基因与 GenBank 中已发表的基因序列完全一致，表明植物表达载体pBI121 hIL 12 构建成功.52.3 转化农杆菌的 PCR 检测从三亲融合后的农杆菌中提取mini Ti 质粒，进行 PCR 扩增，扩增出大小约 1600 bp 的片段，与来自大肠杆菌 DH5α 中的重组质粒 pBI121 hIL 12 为模板的PCR 产物一致，而对照空载根癌农杆菌单菌落为空白，表明获得了2 种含 hIL 12 基因的植物表达载体的农杆菌（图 5）.3 讨论hIL 12 是相对分子质量为 75 ku 的蛋白质，由不同基因编码的2 个亚基 P35 与 P40 两条肽链通过二硫键结合在一起的异二聚体，研究表明，细胞必须同时表达这两个基因才能产生有活性的 IL 12. 我们选用的质粒 pCA13 hIL 12 中的 hIL 12 基因就是利用这两个亚基具有独立的基因序列特点，将 hIL 12 两个亚单位进行融合，中间插入一个 Linker 序列，以保证其基因产物具有正确的蛋白结构及等比例的表达.实验中选用的载体 pBI121 是一个常用的植物表达载体，多克隆位点上游带有 CaMV35S 启动子，在植物组织中能启动外源基因的表达，下游带有 GUS 报告基因，由于酶切位点的要求，本实验的GUS 已被切除，切除了 GUS 报告基因，给转化子的筛选带来了不便，但这一缺憾可以通过特异性引物进行 PCR 检测来弥补；在NOS 启动子下游带有 NPTII 基因，可进行 Kanamicin 抗性筛选.6Mason 等［5］提出了利用植物作生物反应器生产口服疫苗的设想. 我们构建的植物表达载体 pBI121 hIL 12，可以用于马铃薯、烟草、番茄等植物的转化，从而为用植物作为生物反应器生产药用蛋白提供实验基础. 目前，将 hIL 12 基因转入马铃薯的工作正在进行中. 我们成功构建了 hIL 12 基因的植物表达载体，为最终实现用植物生产 hIL 12 奠定了基础 .【参考文献】［ 1］ Hirota T, Suzuki Y, Hasegawa K, et al. Functional haplotypes of IL 12B are associated with childhood atopic asthma ［ J］. J Allergy Clin Immunol, 2005,116(4):789-795.［2］ Inoue Y, Nakayama Y, Minagawa N, et al. Relationship between interleukin 12 expressing cells and antigen presenting cells in patients with colorectal cancer ［J］.Anticancer Res, 2005,25(5):3541-3546.［3］ 李霞，张璟，苏金，等 . 人 cbl 基因真核表达载体的构建及表达［J］. 第四军医大学学报，2004, 25(24):2209-2211.［4］ 王关林，方宏筠 .　植物基因工程［M］. 第 2 版，北京:科7学出版社,2002:739-740.［5］ Mason HS, Lam DM, Arntzen CJ. Expression of Hepatitis B Surface Antigen in Transgenic Plants ［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89:11745-11749.。