人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定.doc

1人端粒酶逆转录酶基因 RNAi 表达载体的构建、鉴定作者：毛立军，郑骏年，李望，郑宏祥，刘俊杰，孙晓青，陈家存，温儒民 【关键词】 重组质粒 摘要 :目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的 RNA 干扰（RNAi）表达载体 方法 化学合成能编码针对 hTERT 基因的短发夹 RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA 表达载体的 U6RNA 聚合酶Ⅲ（PolⅢ ）启动子的下游，构建重组 RNAi 质粒 pSliencer-hTERT 结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点 结论 已成功构建 pSliencer-hTERT 载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础 关键词 :RNA 干扰;短发夹 RNA;人端粒酶转录酶;重组质粒; Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT ）gene.Methods Two template DNA oligonucleotides for shRNA expression targeted hTERT 2gene were chemically synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequence was perfectly correct.Conclusion RNAi expression vector targeting hTERT gene has been constructed successfully and will be used as a useful method to develop specific hTERT-silencing therapeutics. Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant plasmid 端粒酶的活化与恶性肿瘤的发生、发展密切相关，通过激活端粒酶，端粒 DNA 得以延长使细胞永生。

端粒酶逆转录酶（hTERT）是催化这一反应的惟一限速酶，因此有希望成为肿瘤治疗的理想靶点RNA 干扰是近年迅速发展起来的一项新的基因阻断技术，能特异、高效地阻抑靶基因表达，有望成为肿瘤基因治疗的有力工具［1］ 本实验将针对 hTERT mRNA 的小干扰RNA（siRNA）模板插入 siRNA 表达载体，构建载体 hTERT-siRNA 表达载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础 31 材料和方法 1.1 主要试剂 pSilencer1.0-U6 质粒为美国 Am-bion 公司产品，大肠杆菌 JM109 由徐州医学院生物化学教研室保存T4DNA 连接酶以及小量质粒提取试剂盒购自 Promega 公司，限制性内切酶 BamHⅠ 和 HindⅢ购自 MBI 公司 1.2 实验方法 1.2.1 模板 DNA 合成 选择 2 段 hTERT mRNA 的序列作为RNA 干扰的靶序列，序列一针对的是 hTERT 基因显性失活突变体区（NM003219:碱基序列位置 2182-2200） 序列二采用 Ambin公司的网上设计软件（）进行设计，所对应的的靶序列为 hTERT（NM003219:747-765 ） 。

设计 2 对编码短发夹RNA 序列的 DNA 单链序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′序列二 :P1:5′-GTCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-4GCAACGGCAGACGGCC-3′其顺序为 ApaⅠ酶切位点、19nt 正义序列、9nt loop 接头序列、 19nt 反义序列、 RNA 聚合酶Ⅲ终止子（6 个 T） 、EcoRⅠ酶切位点单链两端包含保护碱基和EcoRⅠ（AATT ）以及 ApaⅠ（GGCC ）酶切残基，能直接与pSilencer1.0-U6siRNA 线性表达载体连接由 Introvigen 生物公司合成 1.2.2 质粒 pSilencer-hTERT 表达载体的构建 1.2.2.1 寡核苷酸的退火 将合成的模板寡核苷酸溶解在100μl 无核酶水中，取 1μl 用 TE（10mmol.LTris，1mmol.L EDTA）稀释，使终浓度为 1g.L。

取正义模板链、反义模板链各 2μl加入 46μl 的退火缓冲液，在 90℃孵育 3min，37℃孵育 1h退火后形成的双链用 3%凝胶电泳，以 10 倍稀释的合成的单正链为对照，检测退火前后电泳图谱是否有变化 1.2.2.2 寡核苷酸与 pSilencer1.0-U6 连接 将针对不同hTERT 序列的 2 对退火后的模板链与 pSi-lencer1.0-U6 线性表达载体连接，重组后的载体命名为 pSilencer-hTERT1、pSilencer-hTERT2按下列操作进行:取 5μl 退火后的模板链用 45μl 无核酶水稀释成终浓度 8mg.L，建立 10μl 反应体系:1μl 上述稀释退火模板链、6μl 无核酶水、 1μl10×T4DNA 连接酶缓冲液、1μl 5pSilencer1.0-U6、1μl T4DNA 连接酶（5U.μl） 16℃ 孵育过夜将重组载体转化感受态细胞 JM109 后提取质粒 1.2.3 阳性克隆鉴定 1.2.3.1 酶切鉴定 用 BamHⅠ或 HindⅢ单酶切重组质粒，所有各管于 37℃水浴过夜取 7μl 样品在 1%琼脂糖凝胶和 TAE 缓冲液中 80V 电泳 0.5h 观察结果。

阳性克隆应该不能够被 HindⅢ 单酶切，但可被 BamHⅠ切出大约 370bp 的小条带 1.2.3.2 测序鉴定 将 BamHⅠ和 HindⅢ酶切后电泳出现大约 370bp 的阳性重组质粒送到上海英俊生物工程有限公司测序 2 结果 2.1 退火寡核苷酸与单链寡核苷酸电泳结果 从电泳图（图1）可见，退火前后寡核苷酸电泳图谱明显不同Lane1 条带位置在 100bp 之前，约 60bp 左右Lane2 电泳图谱出现 3 条带，前面的 2 条与 Lane4 的 2 条带相似，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可能是 2 条单链的自身的连接，另一条带在 100bp 位置上，可能是单链自身折叠形成了发夹结 构，虽然分子量缩小，但由于发夹结构这种构象的改变，导致了电泳迁移速率放慢Lane3 与 Lane1 相似，而 Lane4 出现 2 条带，前面的应该是单链寡核苷酸，后面的可6能是 2 条单链的自身的连接从电泳图可见序列一的单链自身折叠以及 2 条单链的自身的连接程度比序列一明显得多 图 1 退火寡核苷酸与单链寡核酸电泳图（略） 1、2 分别是序列一退火后、单链核苷酸 ;3、4 分别是序列二退火后、单链核苷酸;M 为 marker 2.2 重组质粒酶切结果 将菌落扩增后提取质粒，酶切鉴定结果显示:2 条序列构成的重组质粒都不能被 HindⅢ单酶切，但可被BamHⅠ切出大约 350bp 大小的片段（图 2） 。

图 2 重组质粒酶切电泳图（略） 1、2 分别是序列一、二的重组质粒 ;3、4 分别为 HindⅢ 酶切后重组质粒;5、6 分别为 BamHⅠ酶切后重组质粒 2.3 测序结果 由序列一构成的重组的阳性 RNAi 载体反复测序时信号都无法通过造成测序失败，由序列二构成的重组的阳性RNAi 载体测序的结果，与我们设计合成的靶向 hTERT 的正义链完全一致，说明本实验已把合成的寡核苷酸插入到了 RNAi 载体pSilencer1.0-U6siRNA 中，成功构建了能靶向端粒酶 hTERT 基因的 pSilencer1.0-U6siRNA 载体 73 讨论 RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是由于与靶基因序列同源的双链 RNA（ dsRNA）引发的序列特异性转录后基因沉默过程，该技术已成为生物学研究进展最快的领域之一最初是利用化学合成的 siRNA 实现 RNAi，但 siRNA 作用时间短暂，进入细胞后很快被降解，24h 后阻抑效果降低，作用持续时间约 48h为克服此缺陷，人们设想出利用载体介导 siRNA 体内表达技术，其原理是将 siRNA 对应的 DNA 模板插入载体中位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子下游，在 RNA 聚合酶 Ⅲ作用下转录产生含发夹状结构的siRNA（shRNA ） ［2］ 。

据此，Brummelkamp［3］ 设计出针对靶基因的 siRNAs 的模板 DNA，将其与质粒连接后转染细胞，结果 DNA 模板在细胞内转录形成的 shRNA 具有与 siRNA 同样的抑制靶基因表达作用，更为重要的是这种作用可持续 2 个月 siRNA 序列的选择常遵循如下规则:其长度通常为 19～21 个碱基，一般从基因编码序列或 cDNA 序列的起始密码开始，向下游寻找腺苷二核苷酸（AA） ，标记并选择每个 AA 及其下游邻近的 19个核苷酸序列一起作为 siRNA 的靶序列在设计 siR-NA 的过程中，要避开 cDNA 的 5′和 3′非编码区（un-translated regions，UTRs ）以及 5′起始密码区附近 50～100 个核苷酸的序列，因为在这些区域含有丰富的蛋白结合位点，结合的调节蛋白以及形8成的翻译起始复合物等可以影响 siRNA 与 dsRNA 诱导的沉默复合体（RNA induced silencing complex，RISC ）结合到靶 mRNA上［4］ 所选择的 siRNA 序列必须进行全基因组扫描（BLAST）和序列同源分析 本实验设计的 siRNA 模板序列顺序为:正义链 （19nt）―loop 环区（TTCAAGAGA）―反义链（19nt）―RNA 聚合酶Ⅲ终止子（TTTTTT ） 。

所用载体为: 当其插入 pSilencer1.0-U6 线性化质粒 U6 启动子下游后，在 RNA 聚合酶Ⅲ作用下转录产生含发夹状结构的 siRNA，当转录至模板上的一连串 T 时转录终止 本实验选择的序列二经酶切、测序鉴定证实成功构建了hTERT siRNA 表达质粒 pSliencer-hTERT采用的序列一曾被Kosciolek 等［5］ 作为靶序列化学合成 siRNA，并且在肿瘤细胞中证明有效本实验以此序列构建载体，酶切证实 siRNA 模板已插入载体，但在重组质粒测序的过程中，反复出现没有信号的现象，分析其原因可能是由于 G.C 含量过高，形成二级结构使测序信号无法通过造成的。