人正常和退变腰椎间盘中TIMP1的表达及其意义.doc

1人正常和退变腰椎间盘中 TIMP1 的表达及其意义【摘要】 目的 探讨金属蛋白酶组织抑制因子 1 （TIMP1）mRNA在正常与退变椎间盘中表达的差别及意义方法 利用荧光定量PCR 技术检测 TIMP1 mRNA 在正常椎间盘（9 个）与退变椎间盘（30 个）组织的含量，结合年龄、病程、病理类型进行分析结果 TIMP1 在正常椎间盘组织表达量为 0.900±0.289，退变椎间盘中TIMP1 mRNA 表达量为 0.340±0.241，两者差异有显著性（t=5.841,P<0.05） 退变椎间盘中，不同年龄、病程及病理类型组间 TIMP1 mRNA 的表达量差异无统计学意义结论 TIMP1 mRNA 的含量下降在腰椎间盘退变过程中起着重要作用，但未见与年龄、病程及病理类型有明显的关系 【关键词】 椎间盘 金属蛋白酶 1 组织抑制剂 人 ［ABSTRACT］ Objective To study the expressions and their significance of tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1) in normal and degenerative lumbar intervertebral discs. Methods A real time fluorescence quantitative RT PCR was used to detect the content of mRNA of TIMP1 in normal and degenerative lumbar intervertebral discs. The results were analyzed in conjunction with the age, history and pathological types. Results TIMP1 was expressed mostly largely in the normal discs, and less in the degenerative ones. 2No significant differences of expression of TIMP1 mRNA were noted in terms of the age, history and pathological types in the degenerative discs. Conclusion The decrease of TIMP1 plays an important role in the process of the disc degeneration, which has no obvious association with the age, history and pathological types. ［ KEY WORDS］ Intervertebral disc; Tissue inhibitor of metalloproteinase 1; Persons 腰椎间盘突出症是引起腰腿痛的主要疾病之一。

腰椎间盘突出的病理实质为腰椎间盘退变，其病理生物学基础为椎间盘基质合成和降解的失衡基质金属蛋白酶（MMPs）为降解细胞外基质的重要细胞因子，而基质金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）则为 MMPs 的特异性拮抗剂国内外研究结果显示，基质金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）在冠状动脉疾病、肺脏疾病、肠道肿瘤、肝细胞瘤中有多种生物学功能[1～4]，但是 TIMP1 在人正常和退变椎间盘髓核组织中的表达情况仍不清楚本实验旨在探讨 TIMP1 mRNA 在正常与退变椎间盘中表达的差别及意义 1 材料和方法 1.1 材料 RNA 提取试剂 TRNzol A+ （TIANGEN 公司） ，Takara 荧光定量 PCR 试剂盒（大连宝生物公司） ，荧光定量 PCR 仪器（美国 ABI公司 7500 定量 PCR 仪） TIMP1 和内参 GAPDH 的上下游引物3由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，荧光探针由大连宝生物公司合成 1.2 方法 1.2.1 椎间盘的收集与分组 正常组：9 个正常的椎间盘取自 3 名意外死亡的正常人，均为男性，年龄 18～22 岁，平均年龄 20.33 岁退变组：30 个退变椎间盘取自 2006 年 8～10 月青岛大学医学院附属医院脊柱外科因椎间盘突出症而手术的病人，男 18 例，女 12 例，年龄 24～72 岁，平均年龄 45.90 岁。

所有椎间盘髓核组织均在无菌条件下取出后迅速放于-80 ℃冰箱冻存 1.2.2 总 RNA 的提取及 cDNA 的合成 采用 TRNzol A+ RNA 提取试剂按操作说明提取正常及退变椎间盘的总 RNA，紫外线分光光度计测定 A260 的值以估算总RNA 浓度，测定 A260/280 的值来检测 RNA 的纯度用PrimeScriptTM RTReagent 试剂盒将 mRNA 反转录为 cDNA反应体系为：5×buffer 2 μL，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix Ⅰ 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL， Random 6 mers 0.5 μL，Total RNA 1 μg，加 RNase Free dH2O 至总体积 10 μL，将上述反应液混匀后置于 37 ℃水浴中作用 15 min 后，置于 85 ℃水浴中 5 s，使酶灭活 1.2.3 实时荧光定量 PCR 引物设计合成 TIMP1 的引物序列，上游引物 F: 45′ GCTTCTGGCATCCTGTTGTTG 3′;下游引物 R: 5′ CTTCTGGTGTCCCCACGAACT 3′；Taqman 探针:5′ AGACGGCCTTCTGCAATTCCGACCT 3′，扩增片段长度 133 bp。

内参 GAPDH 的引物序列，上游引物 F: 5′ CTTAGCACCCCTGGCCAAG 3′；下游引物 R: 5′ GATGTTCTGGAGAGCCCCG 3′； Taqman 探针：5′ CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA 3′，扩增片段长度 150 bp 1.2.4 实时荧光定量 PCR 扩增 取样品在荧光定量 PCR 仪上进行扩增反应体系 Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL：PCR Forward Primer 0.8 μL， PCR Reverse Primer 0.8 μL，TaqMan 探针 0.8 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL 模板 cDNA 2 μL， dH2O 5.2 μL其反应条件为：95 ℃预变性 10 s 后，95 ℃ 5 s、 62 ℃ 45 s,共 40 个循环 1.2.5 数据处理及统计学分析 采用相对定量法，在测定目的基因的同时测定内源性看家基因 GAPDH，用以标准化样本采用 2-△△CT 计算目的基因的相对表达量[5]统计学分析△△CT=(CT,Target－CT,GAPDH)Time x－(CT,Target －CT,GAPDH)Time 0。

CT 值表示样品扩增产物的荧光信号达到所设定的荧光阈值时需要的循环数，由荧光 PCR 仪在扩增过程中自动读出应用 SPSS 13.0 软件进行统计学分析正常组5与退变组以及不同病理类型之间比较采用两样本均数 t 检验不同年龄间和不同病程间比较采用单因素方差分析 2 结 果 2.1 总 RNA 提取纯度及浓度检测 测得总 RNA 的 A260 的值为 1.8～2.1，说明提取纯度较高，A260/280 的值为 0.5～1.0，说明提取浓度适中 2.2 正常组与退变组 TIMP1 mRNA 含量的比较 正常组中 TIMP1 mRNA 的表达量为 0.900±0.289，退变组的表达量为 0.340±0.240，两组比较，退变组 TIMP1 的含量较正常组明显减少，差别具有统计学意义（t=5.841，P<0.05) 2.3 不同年龄组 TIMP1 含量的比较 按不同年龄段将退变椎间盘分成 4 组，年龄<30 岁组（n=3）表达量为 0.247±0.216，30 ～40 岁组（n=8）表达量为0.346±0.295，41～50 岁组（n=11）表达量为 0.439±0.260，年龄>50 岁组（ n=3）表达量为 0.296±0.241，各年龄组间差别无统计学意义（F=1.113，P>0.05)。

2.4 不同病程组 TIMP1 含量的比较 按不同病程分成 3 组，病程<6 个月组(n=9) 表达量为0.216±0.129，病程 6～12 个月组(n=12)表达量为 0.342±0.179，病程>12 个月组(n=9)表达量为 0.276±0.145，各组间差异无统计学意义（F=1.718，P>0.05) 2.5 不同病理类型组 TIMP1 含量的比较 6依据术中所见将突出椎间盘分为 2 组，包含型组（n=5）表达量为 0.377±0.144，突出游离型组（n=25）表达量为0.301±0.207，两组间差异无统计学意义（ t=0.781，P>0.05)3 讨 论 椎间盘退变机制较复杂，其中椎间盘基质的合成与降解失衡是重要的病理基础，MMPs 与 TIMPs 在椎间盘基质平衡中为重要的因素之一MMPs 是细胞外基质降解过程中主要细胞因子，几乎能够降解多糖以外的所有细胞外基质成分，它还可以激活其他 MMPs 产生连锁放大效应，而 TIMP1 则是 MMPs 的特异性和内源性抑制因子之一，可以非共价结合的方式与有活性的 MMPs 1∶1 稳定结合而发挥作用[6]同时，TIMP1 还有抑制细胞凋亡，刺激增殖的作用[7]。

本实验通过对正常和退变椎间盘组织中 TIMP1 mRNA 含量的分析显示，与正常椎间盘相比，退变椎间盘组织中 TIMP1 mRNA 的含量明显下降，表明 TIMP1 对上述拮抗 MMPs 作用的影响减小，导致椎间盘退变 在不同年龄组之间，年龄<30 岁组 TIMP1 表达量较 41～50岁组减少，表明在早期的椎间盘突出中，TIMP1 的减少起着较大作用，而在中老年病人中，随着椎间盘细胞的凋亡及生物学活性的降低[8]，基质合成减少，同时 TIMP1 也失去了作用的靶细胞由于年龄<30 岁组样本量较少，未能得出统计学差别 7分析不同病程和病理类型与 TIMP1 mRNA 下降的关系，没有得出统计学上的差异，可能在椎间盘突出病人中，TIMP1 下降与病程和病理类型无关 由于所有退变的标本均来自于因腰椎间盘突出症而手术的病人，其椎间盘退变程度较重，故未能观察轻度退变时椎间盘中 TIMP1 mRNA 的含量，两者是否存在关联性仍有待于进一步研究 【参考文献】 [1]SUN G L, ZHAO S, LI P, et al. Expression of tissue inhibitor of metalloproteinase 1 in progression muscular dystrophy[J]. Neurosci Bull, 2006,22(2):85 90. [2]JGUIRIM SOUISSI I, JELASSI A, ADDAD F, et al. Plasma metalloproteinase 12 and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 levels and presence, severity, and outcome of coronary artery disease[J]. Am J Cardiol, 2007,100(1):23 27. [3]XIN X F, ZHAO M, LI Z。