镍琼脂糖凝胶FF（镍NTA琼脂糖凝胶FF）.pdf

北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548 １１镍琼脂糖凝胶 镍琼脂糖凝胶 FF（镍 NTA 琼脂糖凝胶 （镍 NTA 琼脂糖凝胶 FF）） 一、 简介一、 简介 金属螯合亲和色谱，又称固定金属离子亲和色谱，其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸能与多种过渡金属离子Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe3+发生特殊的相互作用，利用这个原理可以把富含这类氨基酸的蛋白质吸附，从而达到分离的目的由于这个原因，偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合，但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力 和镍琼脂糖凝胶相比，镍 NTA 琼脂糖凝胶 FF 具特异性好流速快，螯合镍更稳定，能耐受更高的还原剂，物理和化学稳定性好，批次重复性好已经螯合好镍离子，使用更方便，由于颗粒粒度均匀，粒径小，所以分离效果更好，可完全代替进口产品。

二、 填料特征：二、 填料特征： 特点 基团密度高，载量大，分辨率高，使用方便 基质 6%的交联琼脂糖凝胶 配基 Ni2+配基密度 20-40μmol /ml 吸附载量 ≤15mg/ml 填料的颗粒大小 45-165μm 最大流速 600cm/h pH 范围 3-10，在位清洗时 pH 范围可到 2-11 保存温度 +4~8℃ 保存液体 20%乙醇 三、 适用范围三、 适用范围 分离能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白及带 His 标签的重组蛋白 四、 应用实例四、 应用实例 实验名称：实验名称：镍琼脂糖凝胶 FF 色谱分离带 His 标签的重组蛋白 实验步骤：实验步骤： 1、 镍琼脂糖凝胶 FF 装柱，1.6×20cm，柱床体积为 10ml 2、 用缓冲液缓冲液 1 平衡 2-5 个床体积，流速为 2ml/min 3、 将 20ml 细胞破碎液(50 mM PBS，pH7.4，0.5M NaCl)0.45μm 滤膜过滤，上样，流速为 1ml/min 北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548 ２２4、 用缓冲液缓冲液 1 再洗 2-5 个床体积，流速为 2ml/min 5、 用分别含 10、20、50、100、200、300、400mM mM 咪唑的缓冲液缓冲液 3 进行阶段洗脱，流速为 2ml/min，收集各阶段洗脱峰，用 SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度 6、 用纯水流洗 5 个柱床体积，再用 20%的乙醇流洗 3 个柱床体积，流速为 2ml/min，柱子置于+4~8℃环境中保存 7、色谱图见图 1，SDS-PAGE 结果见图 2。

缓冲液组成：缓冲液组成： 缓冲液缓冲液 1：： 50mM pH7.4 的PBS缓冲液 配制： 0.5M NaH2PO4 19ml， 0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g, 加适量水溶解后定容到 1000ml 缓冲液缓冲液 2：： 50mM磷酸盐缓冲液， pH7.4， 即pH7.4 的PBS溶液 配制： 0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g和咪唑 34g, 加适量，水调pH后定容到 1000ml 缓冲液缓冲液 3：：不同咪唑浓度的缓冲液 B 配制： 咪唑浓度咪唑浓度 缓冲液缓冲液 1 量量(ml) 缓冲液缓冲液 2 量量(ml) 10 mM 98 2 20 mM 96 4 50 mM 90 10 100 mM 80 20 200 mM 60 40 300mM 40 60 400 mM 20 80 SDS-PAGE 流程：流程： 1 BCA 法测量样品蛋白浓度 2 根据测定样品的蛋白浓度，算出 5-10µg/孔所需的体积 3 向 1.5ml EP 管中加入含 5-10µg 蛋白的样品溶液， 若体积小于 10µl， 则加 20mM PBS pH7.4 补足 10µl；若体积大于 10µl，则要加入 1ml 无水乙醇，－20℃下浓缩 1h。

4 取浓缩样品 10000rpm 离心 15min，除去上清，37℃烘箱 10min 去除残余的乙醇 5 在样品加入 20mM PBS pH7.4 和 2×loading buffer 各 10µl，100℃下 10min取出后用冷 却 30s，4000rpm 离心 1s 6 点样，电泳 实验结果：实验结果： （一） 使用镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离（一） 使用镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离 His 标签重组蛋白标签重组蛋白 使用色谱填料为镍琼脂糖凝胶 FF，His 标签重组蛋白的上样量为 20ml，用分别含 10、20、 50、100、200、300、400mM 咪唑的缓冲液 B 进行洗脱，色谱结果见图 3，色谱各组分的SDS-PAGE 结果见图 4 北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548 ３３0501000255075100125150175Vol(ml)A280(mAu)穿透 洗脱 16 5 324图图 1. 镍琼脂糖凝胶镍琼脂糖凝胶 FF 纯化带纯化带 His 标签重组蛋白标签重组蛋白 1 2 3 4 5 6 7 8 9 图图 2. SDS-PAGE 图谱图谱 1：标准蛋白，2：上样液，3：穿透，4：20mM 咪唑洗脱，5：50mM 咪唑洗脱峰，6：100mM 咪唑洗脱峰，7：200mM 咪唑洗脱峰， 8：300mM 咪唑洗脱峰，9：400mM 咪唑洗脱峰 （二） 镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离（二） 镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离 His 标签重组蛋白包涵体标签重组蛋白包涵体 条件和前面的方法基本相同，只是缓冲液中加了 8M 的脲，溶液配方如下表，其纯化 色谱图和电泳图见图 3、4。

要注意的是不同的包涵体溶解度不同，也可以用 6M 盐酸胍代替 8M 脲，因为盐酸胍 溶解包涵体更完全 缓冲液组成：缓冲液组成： 缓冲液缓冲液 1：： 50mM pH7.4 的PBS缓冲液 配制： 0.5M NaH2PO4 19ml， 0.5M Na2HPO4 81ml，NaCl 29.3g 和脲 480 g，加热溶解后定容到 1000ml 缓冲液缓冲液 2：： 50mM磷酸盐缓冲液， pH7.4， 即pH7.4 的PBS溶液 配制： 0.5M NaH2PO4 19ml，0.5M Na2HPO4 81ml， NaCl 29.3g， 咪唑34g和脲480 g， 加热溶解后定容到1000ml 缓冲液缓冲液 3：：不同咪唑浓度的缓冲液 B 配制： 咪唑浓度咪唑浓度 缓冲液缓冲液 1 量量(ml) 缓冲液缓冲液 2 量量(ml) 50 mM 90 10 400 mM 20 80 01002003000100200300400volume(ml)A280(mAu)图图 3镍琼脂糖凝胶镍琼脂糖凝胶 FF 纯化包涵体蛋白纯化包涵体蛋白 1 2 3 4 图图 4SDS-PAGE 图图 1：包含体，2：穿透，3：50mM 咪唑洗脱，4：400mM 咪唑洗脱峰。

（三） 不同金属离子及洗脱条件对纯化效果的影响（三） 不同金属离子及洗脱条件对纯化效果的影响 使用色谱填料为镍琼脂糖凝胶 FF， His 标签重组蛋白的上样量为 10ml， 用含有 20、 50、 100、200、500mM 咪唑的缓冲液 3 洗脱，缓冲液 1 和 2 均加入终浓度为 1%的吐温 80，其 结果表明加入表面活性剂可以降低杂吸附此外分别螯合铜钴金属离子做同样的纯化实验， 结果表明在回收率和纯度上都以螯合镍离子的效果最好，其分离纯化的纯度可以＞90%，而北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548 ４４北京韦氏博慧色谱科技有限公司 北京经济技术开发区同济中路甲 7 号 B 座 931 室 邮政编码：100176 TEL：010-67804548 13911415318 FAX：010-67804548 ５５目标蛋白的回收率高达 80%，所以建议首选镍离子螯合填料，别的可以不用考虑 五、 应用的注意事项：五、 应用的注意事项： 镍琼脂糖凝胶镍琼脂糖凝胶 FF 的配基是最经典的的配基是最经典的 IDA，镍离子有六个螯合价数，，镍离子有六个螯合价数，Ni-IDA 螯合了三 价， 剩余三价， 而螯合了三 价， 剩余三价， 而Ni-NTA是四价的， 剩余是两价， 因此是四价的， 剩余是两价， 因此Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA 琼脂糖凝胶的强，也正因为这个原因，所以在同样条件下琼脂糖凝胶的强，也正因为这个原因，所以在同样条件下 Ni-IDA 洗杂质和目标蛋白的要比洗杂质和目标蛋白的要比 Ni-NTA 的咪唑浓度高，但是的咪唑浓度高，但是 NTA 的填料更稳定，耐受更强的还原剂，更不容易脱落。

而的填料更稳定，耐受更强的还原剂，更不容易脱落而 IDA 的载量要比的载量要比 NTA 高，可以反复利用，更加经济高，可以反复利用，更加经济 本公司的镍琼脂糖凝胶由于配基密度高，所以载量和作用力都比进口的都大和这些 填料相比需要更强的洗脱条件， 特别是和本公司的镍琼脂糖凝胶由于配基密度高，所以载量和作用力都比进口的都大和这些 填料相比需要更强的洗脱条件， 特别是和 NTA 类的填料相比， 镍琼脂糖凝胶需要类的填料相比， 镍琼脂糖凝胶需要 50-100mM 咪唑洗去杂质，也可以直接在上样的样品中加咪唑洗去杂质，也可以直接在上样的样品中加 30-40mM 咪唑提高特异性，洗脱也许需要高 到咪唑提高特异性，洗脱也许需要高 到 500mM 咪唑所以不能完全照搬咪唑所以不能完全照搬 NTA 填料的洗脱条件此外我们也提供镍填料的洗脱条件此外我们也提供镍 NTA 琼脂糖 凝胶，它一般要用琼脂糖 凝胶，它一般要用 25-40mM 咪唑洗杂蛋白，用咪唑洗杂蛋白，用 250-400mM 咪唑洗脱目标蛋白，同样可以 在上样样品和平衡缓冲液中添加咪唑洗脱目标蛋白，同样可以 在上样样品和平衡缓冲液中添加 10-20mM 咪唑提高特异性。

而具体用哪个填料完全看个人 的习惯以及纯化的条件而决定咪唑提高特异性而具体用哪个填料完全看个人 的习惯以及纯化的条件而决定 1) 色谱柱装填色谱柱装填 1、所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理 2、在柱子下端加入蒸馏水，以除去柱子中的空气，关闭柱子出口，在柱内保留少量的 蒸馏水 3、将琼脂糖凝胶连续倒入柱子时，要用玻璃棒的紧靠柱子内壁引流，以减少气泡的产 生，让填料先自然沉降 4、柱压不超过 0.3MPa，如果装柱系统中无法测柱压，则控制流速高于 300cm/h，但 是在使用中一般只用最大流速的 75% 2）固定金属离子）固定金属离子 1、金属离子的固定必须用过滤好的金属离子溶液，以防止金属盐在胶上沉淀 2、用 2-5 倍柱床体积的蒸馏水充分平衡柱子 3、选择合适的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，Fe。