蛋白质印迹热敏水凝胶及壳聚糖凝胶聚合物的制备及识别性能研究.pdf

学校代号：1 0 5 3 2学号：S 1 0 1 1 1 0 6 7密级：湖南大学硕士学位论文蛋白质印迹热敏水凝胶及壳聚糖凝胶聚合物的制备及识别性能研究学位申请人姓名：导师姓名及职称：培养单位：专业名称：论文提交日期：论文答辩日期：答辩委员会主席：S t u d yo fM o l e c u l a rI m p r i n t e dT h e r m o s e n s i t i v eH y d r o g e l sa n dM o l e c u l a rI m p r i n t e dC h i t o s a n —g e l so nt h eR e c o g n i t i o nf o rt h ep r o t e i nb yR a nD a l lB ．E ．( H u n a nU n i v e r s i t y ) 2 010At h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h eR e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo fM a s t e ro fS c i e n c el nA n a l y t i c a lC h e m i s t r yi nt h eG r a d u a t eS c h o o lo fH u n a nU n i v e r s i t yS u p e r v i s o rP r o f e s s o rW r A N GY u z h iJ u n e ，2 0 1 3湖南大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担作者签名：扣1 日日期：j p 哆年乡月} 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文本学位论文属于1 ．保密口，在一年解密后适用本授权书2 ．不保密团 请在以上相应方框内打”√”)作者签名：导师签名：墙冉眦日期：- j 3 年6 月f 日日期：2 口f 5 年石月，日硕士学位论文摘要分子印迹技术是一种为获得与目标分子在空间结构和结合位点完全匹配的聚合物的制备技术与天然受体相比，分子印迹技术制备的聚合物具有稳定性好、低成本、可重复使用等优点近年来，有关小分子印迹技术取得了显著进展及广泛应用然而，有关蛋白质生物大分子的研究，进展相对缓慢究其原因，主要是由于蛋白质存在分子尺寸大、构象灵活、功能基团结构复杂、水溶性等特点，使得传统的小分子印迹技术推广到生物大分子存在固有的局限性。

考虑到蛋白质的天然识别体系特征，本研究通过引入热敏单体制备了热敏性水凝胶、均相接枝共聚制备了壳聚糖凝胶及双功能单体联用制备了壳聚糖凝胶聚合物，考察了制各的聚合物凝胶吸附性能及分子特异识别性能，并对其应用于蛋白质分离识别领域做了初步探索具体内容如下：( 1 ) 热敏水凝胶的制各及应用于牛血清蛋白的识别和分离研究以牛血清蛋白为模板，通过引入N ．N ．异丙基丙烯酰胺( N I P A A m ) 热敏单体，分别在冰冻聚合( ．2 0 0 C ) 及常温聚合( 2 5 0 C ) 条件下，制备了热敏型分子印迹水凝胶采用环境扫描电镜及红外光谱对制备的热敏水凝胶进行表征比较考察了丙烯酰胺( A A m ) 和甲基丙烯酸羟乙酯( H E M A ) 两种结构功能单体，对热敏水凝胶的溶胀性能、温敏性能等进行了探究，并结合S D S - P A G E 凝胶电泳技术对混合复杂样品的分离应用进行评价分析实验结果表明，制备的热敏水凝胶对环境温度变化能产生敏感的刺激响应，冰冻聚合( 一2 0 0 C ) 有利于形成三维互补孔穴网络结构，．2 0 0 c 及2 5 0 C 条件下制备的印迹水凝胶最大理论饱和吸附容量分别为9 5 ．9 7m g ／g 及8 2 ．5 8m g ／g ，平衡吸附时间为2 0h ，平衡吸附浓度为2 ．0m g ／m L ，S D S ．P A G E 分析结果显示，制备的热敏水凝胶对模板蛋白牛血清B S A 具有较好的亲和性，能特异性选择性识别混合样品中目标分子。

2 ) 壳聚糖凝胶分子印迹聚合物识别卵清蛋白的研究以卵清白蛋白为模板，分别以丙烯酰胺( A A m ) 、丙烯酸( A A ) 、甲基丙烯酸( M A A ) 、甲基丙烯酸羟乙酯( H E M A ) 为结构功能单体，采用均相接枝共聚制备了分子印迹壳聚糖凝胶聚合物场发射扫描电镜表征了印迹与非印迹壳聚糖凝胶表观形貌差异，红外光谱表征了吸附前后红外吸收变化考察了单体用量、交联度、聚合温度等因素对壳聚糖凝胶性能的影响结合高效液相色谱分析( H P L C ) 探究了壳聚糖凝胶对目标分子的吸附性能及选择性识别性能结果表明，以丙烯酰胺( A A m ) 和甲基丙烯酸( M A A ) 为结构功能单体制备的壳聚糖凝胶对模板蛋白具有较好的识别性能( I F 分别为1 ．4 7 2 和1 ．2 3 7 ) ，酸性聚合条件I I蛋白质印迹热敏水凝胶及壳聚糖凝胶聚合物的制备及识别性能研究( p H - - - 4 ．7 ) 有利于分子印迹壳聚糖凝胶的制备，结合蛋白前后红外光谱吸收变化及Z e t a 电位分析证实氢键及静电键合作用力的存在H P L C 分析结果显示，即使在竞争蛋白l y s o z y m e 的存在下，分子印迹识别位点仍对模板保持良好的选择性。

( 3 ) 双功能单体壳聚糖凝胶分子印迹聚合物的制备及性能研究以卵清蛋白为模板，丙烯酰胺( A A m ) 和甲基丙烯酸( M A A ) 为结构功能单体，2 ．丙烯酰胺．2 ．甲基．1 ．丙烷磺酸( A M P S ) 为配位功能单体，采用联用共聚制备了双功能单体壳聚糖凝胶考察了单体配比、交联度等因素对壳聚糖凝胶性能的影响探究了双功能单体壳聚糖凝胶对目标分子的吸附性能及竞争选择性性能结果表明，功能单体A A m ( M A A ) 与A M P S 最佳配比为1 0 ：l 时，制备的双功能单体壳聚糖凝胶平衡吸附时间为2 2 h ，平衡吸附浓度为1 ．5m g ／m L ，竞争蛋白l y s o z y m e 浓度的变化对双功能单体壳聚糖凝胶的选择性识别性能影响不大关键字：分子印迹、蛋白质、热敏水凝胶、壳聚糖凝胶、均相接枝共聚、联用共聚I I I硕士学位论文A b s t r a c tM o l e c u l a ri m p r i n t i n gi sak i n do ft e c h n i q u ew h i c hc r e a t e sa na f f i n i t ym a t r i xc o m p l e m e n t a lt o w a r dt h et e m p l a t em o l e c u l e sb yC O - p o l y m e r i z a t i o no ft h ef u n c t i o n a l m o n o m e r sa n dc r o s s - l i n k e r sa r o u n dt h e m ．C o m p a r e dw i t ht h en a t u r er e c e p t o r , t h em o l e c u l a ri m p r i n tp o l y m e r sp o s s e s st h ef e a t u r eo fr e l i a b i l i t y ，l o wc o s ta n dr e u s a b i l i t y ．R e s e n ty e a r s ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt o w a r ds m a l l e rm o l e c u l a rh a v eag r e a td e v e l o p m e n ta n dw i d ea p p l i c a t i o n ．H o w e v e r ，w h e nc o m p a r e dw i t hs m a l lm o l e c u l e s ，t h ei m p r i n t i n go fb i o ·m a c r o m o l e c u l e sp a r t i c u l a r l yp r o t e i nd e v e l o p e dr e l a t i v e l ys l o wa n di m m a t u r e l y ．T h e r ea r em a n yi n h e r e n tp r o b l e m sw i t ht h ep r o t e i nh i n d e r i n gt h ea d v a n c e m e n t ，s u c ha st h eh u g em o l e c u l a rs i z e ，f l e x i b l ec o n f o r m a t i o n ，c o m p l e xc o n s t r u c t i o na n ds o l u b i l i t y ．T a k e nt h en a t u r a lp r o p e r t yo fp r o t e i ni n t oc o n s i d e r a t i o n ，i nt h i sp a p e r ，w ep r e p a r e dt e m p e r a t u r e - s e n s i t i v em o l e c u l a ri m p r i n t e dh y d r o g e lb ya d d i n gak i n do ft h e r m o s e n s i t i v em o n o m e r ，p o l y m e r i z e dc h i t o s a n —g e l sa n db i —f u n c t i o n a lm o n o m e r sc h i t o s a n —g e l sb yg r a f tc o p o l y m e r i z a t i o n ．W ei n v e s t i g a t e dt h ea d s o r b a b i l i t ya n ds e l e c t i v i t yo ft h ep r e p a r e dM I P s ，m a d eap r e l i m i n a r ys t u d yi nt h ea r e ao fp r o t e i np u r i f i c a t i o n ．T h ed e t a i lc o n t e n t sw e r es h o w na st h ef o l l o w i n g ： ( 1 ) T h es y n t h e s i s eo ft h e r m o s e n s i t i v eh y d r o g e l sa n ds e l e c t i v e l yr e c o g n i z a t i o nf o rt h et。