基于PepT1-PPARα靶标组合的中药协同机制解析.docx

基于PepT1PPARα靶标组合的中药协同机制解析 乔连生+陈艳昆+雒刚刚+路芳+刘思佳+李贡宇+张燕玲[摘要] 协同效应是中药发挥药效的主要作用机制，结合关键靶标组合探讨中药的协同效应是阐释中药协同机制的有效方法之一寡肽转运蛋白（peptide transporter 1，PepT1）是药物吸收入血的关键靶标之一，约占总转运蛋白含量的50%过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated recepror α，PPARα）是贝特类降脂药物的作用靶点，其激动剂具有良好的降血脂药效研究表明PPARα可反式激活PepT1的基因表达，PPARα激动剂可促进PepT1底物的吸收，从而共同发挥协同作用因此，本研究拟基于PepT1和PPARα的靶标组合，发现中药活性成分中的PepT1底物和PPARα激动剂，并在一定程度上探讨中药活性成分吸收入血与降低血脂的协同机制该研究基于前期实验室已构建的PPARα激动剂的融合药效团模型，筛选潜在的具有PPARα激动效应的中药活性成分，并追溯其来源中药同时构建PepT1底物的支持向量机模型，预测中药中潜在的PepT1底物。

通过分析2组筛选结果，发现三七-灵芝、三七-丹参组合可能通过PepT1和PPARα协同机制发挥降脂药效该研究基于PepT1-PPARα的靶标组合，探索中药活性成分吸收与降脂药效的协同机制，为基于靶标组合探讨中药药代动力学参与的协同机制研究提供了一条新思路[关键词] PepT1；PPARα；协同机制；SVM；融合药效团；分子对接；虚拟筛选[Abstract] Synergistic effect is main pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine（TCM）. The research method based on the key targets combination is an important method to explore the synergistic effect of TCM. Peptide transporter 1 （PepT1） is an essential target for drug uptake into the bloodstream，accounting for about 50% of the total transporter protein content from the small intestine. Peroxisome proliferator-activated receptor α（PPARα） is the lipid-lowering target of fibrates，which have a good hypolipidemic effect by activating PPARα. It has been reported that PPARα could activate the gene expression of PepT1s，and PPARα agonists can promote the uptake of PepT1 substrates，indicating their synergistic effect. In this paper，PepT1 substrates and PPARα agonists from TCM were discovered，and their synergistic mechanism was also been discussed based on the target combination of PepT1 and PPARα. The support vector machine（SVM） model of PepT1 substrates was first constructed and utilized to predict potential TCM components. Meanwhile，merged pharmacophore and docking model of PPARα agonists was used to screen the potential active ingredients from TCM. According to the analysis results of two groups，the TCM combination of Panax notoginseng and Ganoderma lucidum，as well as TCM combination of P. notoginseng and Salvia miltiorrhiza were identified to have the synergistic mechanism based on target combination of PepT1 and PPARα. In this study，synergistic mechanism of TCM was analyzed for absorption and hypolipidemic effect based on target combination，which provides a new way to explore the synergetic mechanism of TCM related to pharmacokinetics.[Key words] PepT1；PPARα；synergistic mechanism；SVM；merged pharmacophore；docking；virtual screening中药协同效应研究是中药物质基础与作用机制研究的关键，已有研究多是从经典方剂或药对出发，解析其化学组成与物质基础，进一步探讨其发挥药理作用的分子机制，并阐明其协同效应[1-2]。

本研究拟采用逆向的研究思路，即从药物靶标组合出发，结合分子模拟技术，发现潜在的中药活性成分，并在靶标组合的基础上探讨中药的协同机制传统的靶标组合概念特指具有治疗效应的靶标之间的组合，随着概念的延伸，治疗靶标与吸收、转运、代谢等靶标之间组合也被称为靶标组合[3-4]本研究选择的研究载体为寡肽转运体（peptide transporter 1，PepT1）和过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARα）的靶標组合PepT1主要存在于生物体的小肠部位，是经典的药物转运体，具有极宽泛的底物谱，是多种药物吸收入血的重要途径，约占总转运蛋白含量的50%[5]PPARα是经典的降脂靶标，其激动剂贝特类药物具有明确的降脂药效，其降脂机制有别于抑制胆固醇合成通路的HMG-CoA还原酶抑制剂，PPARα激动剂可通过调节血脂的代谢通路从而发挥降脂的药效研究表明PPARα具有调节多种肠道转运体，尤其是PepT1表达的效应，部分PPARα激动剂也被证明具有促进PepT1底物吸收的效应[6-8]，因此，基于此靶标组合探讨中药吸收入血与降低血脂的协同机制对中药药代动力学参与的中药协同机制分析具有重要意义。

本研究针对PepT1和PPARα的靶标组合，首先构建PepT1底物预测的支持向量机模型（support vector machine，SVM），并通过多种内测及外测参数挑选最优的SVM模型基于最优的SVM模型筛选中药中潜在的PepT1底物成分随后，进一步结合实验室已构建的PPARα激动剂的融合药效团模型和分子对接模型，筛选中药中潜在的PPARα激动活性成分追溯2个靶标筛选到的活性成分的来源中药，并结合文献探讨高频中药在方剂和药对中可能存在的协同机制，从PepT1和PPARα靶标组合的角度出发，阐释中药吸收入血与降低血脂的协同机制1 材料与方法1.1 PepT1支持向量机模型的构建与验证1.1.1 数据收集与整理 本文从文献[9-11]中收集PepT1底物共计90个，以此作为阳性化合物构建PepT1支持向量机模型阴性化合物来源于Drugbank数据库（http：//www.drugbank.ca/）中的非PepT1转运的已上市药物首先，利用Discovery Studio 4.0软件计算所有化合物的8个类药性质描述符，包括AlogP、相对分子质量、氢键供体数目、氢键受体数目、可旋转键数目、脂环数目、芳环数目、分子极性比表面积。

随后利用8个描述符，基于主成分分析方法描述化合物的化学结构空间分布[12]通过比较阳性化合物和阴性化合物化学空间的差异，利用随机选取和等距离抽样的方式挑选用于建模的阴性化合物，并利用KS方法实现化合物数据集的划分为使训练集具有较好的代表性，数据集划分应保证训练集中阳性化合物和阴性化合物的比例约为1∶1，内部测试集中阳性样本和阴性样本的比例约为1∶3，外部测试集中阳性样本和阴性样本的比例约为1∶31.1.2 模型的建立 本文利用Dragon 2.1软件计算用于构建模型的化合物的1 481个分子描述符，并利用Weka 3.6.10的BestFirst-D1-N5搜索方法和CfsSubsetEval-P1-E1评估方法，针对训练集和内部测试集的分子描述符，进行降维并去除冗余，得到与所构建模型最相关的分子描述符子集本研究基于训练集化合物利用SVM建立定性预测模型实验所用SVM算法采用台湾大学林智仁提供的网络共享算法libsvm3.1（http：//www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm/），并将3种归一化数据处理方法和4种模型参数寻优方法组合并进行建模，通过比较各模型训练集、内部测试集和外部测试集的评价参数，得到最优建模组合。

归一化数据处理中包括3种处理方法：不处理、[0，1]归一化和[-1，1]归一化模型参数寻优处理中选用RBF核函数，4种参数寻优方法包括：不处理，GS，PSO和GA3种数据处理方式与4种参数寻优方法排列组合共计构建12个SVM模型[13]其中，寻优参数（C，γ）的选择采用逐一交叉验证的方法确定C和γ，取均方根（RMS）最小时的C和γ值，以防止训练集在过拟合的情况下找到最优参数综合考虑各模型间训练集、外部测试集和内部测试集的优劣，选择最优实验方案1.1.3 模型的验证 针对已构建的12个SVM模型，首先利用内部测试集对模型进行评价，评价指标包括准确率（ACC）、灵敏度（SE）和特异性（SP）各项指标数值越大，模型性能越好计算公式为（1）～（3）[14]其中TP为真阳化合物数目，TN为真阴化合物数目，FP为假阳化合物数目，FN为假阴化合物数目ACC=（TP+TN）/（TP+FN+TN+FP）（1）SE=TP/（TP+FN）（2）SP=TN/（TN+FP）（3）随后利用外部测试集对模型进行评价评价指标同样包括：ACC，SE和SP同时，绘制外部测试集的ROC曲线，并计算其曲线下面积（AUC）值，从而共同说明模型的准确性。

随后，利用获得的最优PepT1底物判别模型预测中药化学成分数据库（TCMD）的成分，追溯其来源中药，分析高频中药的药性及功能主治，通过文献验证，说明筛选结果的合理性1.2 基于PepT1-PPARα的协同机制解析利用实验室前期已构建的PPARα激动剂的融合药效团模型，筛选TCMD数据库[15]同时，结合PPARα激动剂的分子对接筛选模型（PDB：3KDU），进一步筛选药效团命中的潜在活性成分，并追溯筛选结果的来源中药随后，针对PPARα激动剂与PepT1底物的来源中药，分析其相互关系，并讨论具有PPARα激动效应的中药成分对P。