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实务专研题究报告指导老师张文兴老师学生陈婉平系级生农.doc

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  • 文档编号:206866937
  • 上传时间:2021-11-02
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    • 研究幸艮生口指^老白而:接文典老白而 孥生:隗婉平系级:生良四甲 孥甄:0951952一、 刖百Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD),是逢檄放 大多形性去氧核糖核酸分型法,是用一段大&勺10-15bp 的引子,以随檄的方式舆待分析的^醴DNA衡亍PCR 反雁,藉由雷泳BI片段逵行指^分析,用来II分彳固醴 ^的差巽RAPD常用来分析毛重舆系重之^的,用已知的 primer拳寸血^相近的品毛重作分析,利用系重舆毛重^微小 片段的差巽,来判别待分析^醴DNA ^的酬系,RAPD 比段像是命十举寸有部份序列相同的基因来做探言寸,且可 在段短的日寺^内得到&吉果(相段於PFLP的 力)二、 材料:岛血(genomic DNA)、Phusion (5xHF buffer,400|il;5xTE,540|il;Phusion DNA polymerase, 10|il;dNTA,50|il)Mg2+、PCR 檄器、agarosePrimer : EcoR I -5 : 5,-(CGAATTCAACGCGCAAC)-3,EcoR I -6 : 5,-(CGAATTCCCCGTCAGCA)-3,三、方法1. 抽1B血的 genomic DNA1-1.取E息血 10|il,加入 500^1 lysis buffer,65C TO min1-2.降温彳爰,加 2|il proteinase K,37C over night1-3.原醴稹 1/10 的白包和 NaCI 12000 rpm 10 min1-4.取上清液,加丽倍 isopropanol ? -20C 5 20 min1-5.在 4Clt心檄 ‘ 12000 rpm 10 min1-6.去上清液,用 75%EtOH 1000|il,wash2 次1-7.在 12000 rpm 10 min,去上清液1-8. DNA乾燥,用20rI TE回溶2. PCR侈美雕子澧度的不同)谕 14彳固 PCR用的tube,分成WI(EcoR I-5& EcoR 1-6)sample l|il0.5^11primerphusion 7.5|il美雕子 0.1.2....6山(分成7系重澧度)TE 6.5.4....0B (分成7彳重澧度)&恩醴稹 15|112-1. hot start,98C 30 秒2-2.denature,98C 10 秒2-3.anealing,36C 15 秒2-4.extention,72C 30 秒2-5.final extention,72C 5 10 分H2-6.cool down,4C 00(2-2~2-4,重褐40彳固循璟)3. 雷泳,雷:桎由^到正100V4. 用EtBr染色敷秒,用清水清洗业退染敷十分童5 .照膝片紫外光照相系统四、W吉果左匮I :由左至右primer是EcoR 1-5,第一彳固舄marker,依序美离隹子澧度由0|11遁增到6出,TE由6出痕咸舄0|11右匮I :由左至右primer是EcoR 1-6,第一彳固舄marker,依序美离隹子澧度由0|11遁增到6出,TE由6出痕咸舄0|11五、:可看出EcoR I -5的DNA小片段事兖舄明H DNA的含量事交多;且在美离隹子澧度舄5|11 5 TE澧度舄1|11日寺,表 琨建到最大量。

      先前的在做到温度梯度的分析日寺,即失败了推测 可能是温度的哉定金昔^,而且DNA的澧度不多句&屯,DNA 再自屯化,再做温度梯度的分析之废做温度梯度日寺,可将温 度提高至36C~50C,以提高暮一性;使用EcoR 1-5 > primer 有段好的效果,莹取美雕子的澧度舄5nl,TE澧度舄mi,希 望可以得到事交理想的&吉果。

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