高中生物课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与记数养课件新人教版选修1.ppt

专题专题2 :2 :微生物的培养与应用微生物的培养与应用（一）筛选菌株（一）筛选菌株自然界筛选：自然界筛选：根据它对生存环境的要求，到相应的根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找环境中去寻找如耐高温的如耐高温的TaqDNA聚合酶聚合酶)实验室筛选：实验室筛选：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件（包括（包括营养、温度、营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其等），同时抑制或阻止其他微生物生长他微生物生长选择培养基：选择培养基：在微生物学中，将在微生物学中，将允许允许特定种类的微特定种类的微生物生长，同时生物生长，同时抑制或阻止抑制或阻止其他种类微生物生长其他种类微生物生长的培养基目的是从众多微生物中分离所需要的的培养基目的是从众多微生物中分离所需要的微生物  1.1.在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是是什么物质？氮源的分别是是什么物质？ 碳源是葡萄糖，氮源是尿素碳源是葡萄糖，氮源是尿素 2.2.分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用分析该配方的培养基对微生物是否具有筛选作用？如果有，又是如何进行筛选的？？如果有，又是如何进行筛选的？能分解尿素的细菌的筛选能分解尿素的细菌的筛选       阅读教材阅读教材2222页第一大段相关内容，并思考回答下列页第一大段相关内容，并思考回答下列问题：问题： 有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分有筛选作用，它的氮源只含有尿素，只有能合成分解尿素的脲酶的细菌才能生长。

解尿素的脲酶的细菌才能生长测定微生物数量的方法：测定微生物数量的方法： 1、、直接计数法：最常用的直接计数法：最常用的显微镜直接计数显微镜直接计数            先将待测样品制成悬液，然后取先将待测样品制成悬液，然后取                                                                                                            一定量的悬液放在显微镜下进行计数根据在显一定量的悬液放在显微镜下进行计数根据在显微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内微镜下观察到的微生物数目来计算出单位体积内的微生物总数的微生物总数优点：设备简单、能观察微生物的形态特征优点：设备简单、能观察微生物的形态特征缺点：缺点：不能不能区分死菌和活菌区分死菌和活菌；；           难以计数微小的细菌难以计数微小的细菌 一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数一般用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数二）统计菌落数目（二）统计菌落数目 2、、间接计数法：间接计数法：最常用最常用稀释稀释涂布涂布平板计数法平板计数法              应用：统计样品中活菌的数目应用：统计样品中活菌的数目    ①①原理原理：：当样品的稀释度足够当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的菌落，来源于样品稀释液中的 一个活菌，通过统计平板上的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

约含有多少活菌     （注意）（注意）：一般选择菌落数在：一般选择菌落数在30-300的平板的平板 进行记数进行记数   ②②操作操作：：a、设置重复组：、设置重复组：增强实验的说服力和准确性增强实验的说服力和准确性将待测样品经过一系列的稀释，选择三个将待测样品经过一系列的稀释，选择三个稀释度的菌稀释度的菌液均匀涂布在平板上，然后培养液均匀涂布在平板上，然后培养         （注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释度（注意）：为了结果接近真实值，可将同一稀释度菌液涂布到菌液涂布到3个或个或3个以上的平板上，经培养，计算出个以上的平板上，经培养，计算出菌落的平均数菌落的平均数教材中用楷体字编排的实例教材中用楷体字编排的实例是为了说明设置重复组的重是为了说明设置重复组的重要性第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复要性第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力第二位同学考虑到设置组，因此结果不具有说服力第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了重复组的问题，涂布了3个平板，但是，个平板，但是，其中其中1个平板个平板的计数结果与另的计数结果与另2个相差太远个相差太远，说明在操作过程中可，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数个平板的计数值用来求平均值。

这个实例启示学生，在设计实验时，值用来求平均值这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性在分析实验结果时，一定要考验的说服力与准确性在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验味着操作有误，需要重新实验b、对照原则：、对照原则：判断培养基中是否有杂菌污染，将未接种判断培养基中是否有杂菌污染，将未接种的培养基同时进行培养的培养基同时进行培养        判断判断选择培养基选择培养基是否具有筛选作用，是否具有筛选作用，对照培养基对照培养基接接种后培养观察菌落数目种后培养观察菌落数目   计算公式：每克样品中的菌株数计算公式：每克样品中的菌株数=（（C/V））ⅹⅹMA同学的结果与其他同学不同，同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种可能的解释有两种：一：一是由于是由于土样不同土样不同，二是由于，二是由于培养基污染或操作失误培养基污染或操作失误究竟是哪个原因，可以通过实验来证明竟是哪个原因，可以通过实验来证明。

实验方案有两种：实验方案有两种：一种方案是可以由其他同学用与一种方案是可以由其他同学用与A同同学一样的土样进行实验，如果结果与学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证同学一致，则证明明A无误；如果结果不同，则证明无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或同学存在操作失误或培养基的配制有问题另一种方案是将培养基的配制有问题另一种方案是将A同学配制的培同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染通过这个事例可以看出，实证明培养基是否受到污染通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的1.原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当原理：尿素是一种重要的农业氮肥，只有当土壤中土壤中 的的 细菌将尿素分解成氨之后，才能细菌将尿素分解成氨之后，才能 被植物利用被植物利用尿素细菌能合成脲酶，在脲酶尿素细菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨的作用下尿素被分解成氨                 CO(NH2)2+H2O             CO2+2NH3脲酶脲酶（（2）实验设计的内容包括）实验设计的内容包括实验方案实验方案、、材料用材料用具具、、实施步骤实施步骤和和时间安排时间安排等。

等3）实验流程：）实验流程：                          土壤取样土壤取样                                                     样品系列稀释样品系列稀释                                                 涂布平板与培养涂布平板与培养                                                                            观察并记录结果观察并记录结果     菌落计数菌落计数 1、、土壤微生物土壤微生物主要分布在距地表主要分布在距地表3～～8cm的近的近中中性性土壤中，约土壤中，约70％～％～80％％为细菌2、分离不同的微生物采用不同的、分离不同的微生物采用不同的稀释度稀释度，其原，其原因是因是不同微生物在土壤中含量不同不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保，其目的是保证获得证获得菌落数在菌落数在30～～300之间、适于计数之间、适于计数的平板细菌细菌稀释度为稀释度为104、、105、、106，，放线菌放线菌稀释度为稀释度为103、、104、、105，，真菌真菌稀释度为稀释度为102、、103、、104。

3、、 培养不同微生物往往需要培养不同微生物往往需要不同培养温度不同培养温度细菌细菌一般在一般在30～～37℃℃培养培养1～～2d，，放线菌放线菌一般在一般在25～～28℃℃培养培养5～～7d，，霉菌霉菌一般在一般在25～～28℃℃的温度下培养的温度下培养3～～4d4、、 在在菌落计数菌落计数时，每隔时，每隔24h统计一次菌落数目统计一次菌落数目选取选取菌落数目稳定菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因时的记录作为结果，以防止因培养时间不足培养时间不足而导致遗漏菌落的数目而导致遗漏菌落的数目         点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落形成肉眼可观察到的菌落5、、菌落的特征菌落的特征包括包括 形状、大小、隆起程度、颜形状、大小、隆起程度、颜色色 等方面实验设计实验设计1. 1.实验名称实验名称土壤中某样品细菌的分离与计数2.2.实验目的（略）实验目的（略）3.3.材料用具（略）材料用具（略）4.4.操作步骤操作步骤  从肥沃、湿润的土壤中取样。

先铲去（铲已经过消从肥沃、湿润的土壤中取样先铲去（铲已经过消毒处理）表层土毒处理）表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先消毒左右，再取样，将样品装入事先消毒过的信封中过的信封中1 1）土壤取样）土壤取样 准备牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组）和选择培养准备牛肉膏蛋白胨培养基（作为对照组）和选择培养基将菌液稀释相同的倍数（见教材基将菌液稀释相同的倍数（见教材2323页页““样品稀释流程样品稀释流程示意图示意图””）稀释倍数为）稀释倍数为 10103 3 ～～10107 7每个稀释度均用每个稀释度均用3 3个个选择培养基，选择培养基，1 1个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要个牛肉膏蛋白胨培养基，共需要1515个选择个选择培养基，培养基，5 5个牛肉膏蛋白胨培养基（都作好标记）个牛肉膏蛋白胨培养基（都作好标记）2 2）制备培养基）制备培养基 （（3 3）高温消毒）高温消毒  将准备好的培养基和将准备好的培养基和8 8支试管、一支移液管（用纸包支试管、一支移液管（用纸包好）放到高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理好）放到高压蒸汽灭菌锅内进行灭菌处理 将将10 g10 g土样加入盛有土样加入盛有90 90 mLmL无菌生理盐水的锥形瓶中无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为（锥形瓶体积为250 250 mLmL），充分摇匀，吸取上清液），充分摇匀，吸取上清液1mL1mL，，转移至盛有转移至盛有9 9 mLmL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至稀释至10107 7稀释度，并按照由稀释度，并按照由10107 7～～10103 3稀释度的顺序分别稀释度的顺序分别吸取吸取0.1mL0.1mL进行平板涂布操作。

按照浓度从低到高的顺序进行平板涂布操作按照浓度从低到高的顺序涂布平板涂布平板4 4）微生物的培养与观察）微生物的培养与观察  将涂布好的培养皿放在将涂布好的培养皿放在30℃30℃温度下培养随着培养时温度下培养随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生比较牛肉膏培养基和选间的延长，会有不同的菌落产生比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-102-10的颜色反应的颜色反应5 5）细菌的计数）细菌的计数  选取菌落数在选取菌落数在3030～～300300的平板进行计数在同一稀释度的平板进行计数在同一稀释度下，至少对下，至少对3 3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目（1）　对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助）　对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生生物化学物化学 的方法。

的方法  (2)　在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的　在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶脲酶 将尿素分解成了将尿素分解成了 氨氨 氨会使培养基的碱性氨会使培养基的碱性 增强增强 ，，PH 升高升高 因此，我们可以通过因此，我们可以通过检测培养基检测培养基 pH 变化变化来判断来判断该化学反应是否发生该化学反应是否发生  (3)　在以　在以 尿素尿素 为唯一氮源的培养基中加入为唯一氮源的培养基中加入 酚红酚红 指示指示剂剂培养某种细菌后，如果培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将升高，指示剂将变变 红红 ，，说明该细菌能够说明该细菌能够 分解尿素分解尿素     [思考思考10]测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝 培养培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑黑 色，通过记述得出水样色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量你认为在该实验中至少应取中大肠杆菌的数量你认为在该实验中至少应取 三三 个水个水样三、结果分析与评价三、结果分析与评价四、课堂总结、点评四、课堂总结、点评实验方案实验方案分离筛选微生分离筛选微生物的原理物的原理有有利利于于目目的的菌菌株株生生长长抑抑制制或或阻阻止止其他微生物生长其他微生物生长人为条件人为条件微生物计数微生物计数方法与原理方法与原理稀释涂布平板稀释涂布平板法显微镜直接法显微镜直接计数法计数法对照设置与对照设置与重复设置重复设置实验设计实验设计实验操作实验操作结果与分析结果与分析土壤土壤中尿中尿素分素分解菌解菌的分的分离与离与计数计数五、课余作业课余作业           活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的活菌计数技术广泛应用于土壤含菌量的测、食品卫生和水源污染度的检测。

测、食品卫生和水源污染度的检测选做：选做：           1、空气中微生物总数的检测、空气中微生物总数的检测           2、水中细菌总数的检测、水中细菌总数的检测           3、牛奶中、牛奶中 细菌的分离与计数细菌的分离与计数           4、土壤中真菌（或放线菌）的分离与、土壤中真菌（或放线菌）的分离与技术技术1.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比（结果与实际值相比（  ）） A.比实际值高比实际值高            B.比实际值低比实际值低 C.和实际值一致和实际值一致        D.比实际值可能高也可能低比实际值可能高也可能低2.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是(    )A. KH2PO4、、Na2HPO4、、MgSO4.7H2O、葡萄糖、、葡萄糖、尿素、琼脂、水尿素、琼脂、水          B. KH2PO4、、Na2HPO4、、MgSO4.7H2O、葡萄糖、、葡萄糖、琼脂、水琼脂、水C. KH2PO4、、Na2HPO4、、MgSO4.7H2O、尿素、琼、尿素、琼脂、水脂、水 D. KH2PO4、、Na2HPO4、、MgSO4.7H2O、牛肉膏、、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水蛋白胨、琼脂、水BA3.（（09安徽卷）下列是关于安徽卷）下列是关于“检测土壤中细检测土壤中细菌总数菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是实验操作的叙述，其中错误的是A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板温、高压灭菌后倒平板B.取取104、、105 、、106倍的土壤稀释液和无菌倍的土壤稀释液和无菌水各水各0.1ml，分别涂布于各组平板上，分别涂布于各组平板上C.将实验组和对照组平板倒置，将实验组和对照组平板倒置，370C恒温培恒温培养养24-48小时小时D.确定对照组无菌后，选择菌落数在确定对照组无菌后，选择菌落数在300以以上的实验组平板进行计数上的实验组平板进行计数D4.(09上海上海)（（9分）氯苯化合物是重要的有机化工原料，分）氯苯化合物是重要的有机化工原料，原因不易降解，会污染环境。

某研究小组依照下列实验原因不易降解，会污染环境某研究小组依照下列实验方案（图方案（图1）筛选出能高效降解氯苯的微生物）筛选出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培菌，培养基配方如表养基配方如表1（（1）配制）配制ⅡⅡ号固体培养基时，除添加号固体培养基时，除添加ⅡⅡ号液体培养基成号液体培养基成分外，还应添加分外，还应添加1%的的_______2）培养基配制时，灭菌与调）培养基配制时，灭菌与调PH的先后顺序是的先后顺序是____3）从用途上来说，）从用途上来说，ⅠⅠ号培养基和号培养基和ⅡⅡ号培养基分别属于号培养基分别属于_____培养基和培养基和______培养基在培养基在ⅡⅡ号培养基中，为号培养基中，为SP1菌提供氮源的成分是菌提供氮源的成分是_______4）在营养缺乏或环境恶劣时，）在营养缺乏或环境恶劣时，SP1的菌体会变成一个的菌体会变成一个圆形的休眠体，这种休眠体被称为圆形的休眠体，这种休眠体被称为_________5）将）将SP1菌接种在含菌接种在含不同浓度氯苯的不同浓度氯苯的ⅢⅢ号培号培养液中培养，得到生长曲养液中培养，得到生长曲线（如图线（如图2）从图2可知可知SP1菌在菌在____________培培养条件下最早停止生长，养条件下最早停止生长，其原因是其原因是____________。

 琼脂琼脂先调先调PH，后灭菌，后灭菌通用通用选择选择硝酸铵硝酸铵芽孢芽孢20mg/L氯苯氯苯氯苯最早耗尽氯苯最早耗尽(09湛江一模湛江一模) 生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源我国利用农作物废弃物源我国利用农作物废弃物(秸秆秸秆)生产乙醇，其技术流程生产乙醇，其技术流程为：纤维素酶解为：纤维素酶解→酵母发酵酵母发酵→蒸馏蒸馏 →成品    (1)纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化纤维素酶的成本能否下降，是能否实现乙醇工业化生产的关键因素纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培生产的关键因素纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌养液中提取某同学设计了如下分离土壤中纤维素分解菌的实验流程：土壤取样的实验流程：土壤取样--选择培养选择培养--梯度稀释梯度稀释--鉴别培养鉴别培养    ①①最好选择怎样的环境采集土样最好选择怎样的环境采集土样?    ②②以下是一种培养基配方：纤维素粉以下是一种培养基配方：纤维素粉5g、、NaN03 1g、、Na2HP04·7H20  1.2g、、KH2P04O.9g、、 MgS04·7H20 O.5g、、  KCl 0.5g、酵母膏、酵母膏0.5g、水解酵素、水解酵素0.5g(蒸馏水定蒸馏水定容到容到1.0mL)。

    该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理该培养基能够增加样品中纤维素分解菌的浓度，其原理是是             选择纤维素丰富的土壤环境选择纤维素丰富的土壤环境培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长生长，同时抑制其他微生物生长③③为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基中加入别培养基中加入                染液，将筛选获得的菌液稀释染液，将筛选获得的菌液稀释后用后用                  法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生                  的菌落作为菌种进行扩大培养的菌落作为菌种进行扩大培养 ④④纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢纤维素分解菌培养液中的纤维素酶产量如何呢?可设可设计实验进行检测，请写出实验思路：计实验进行检测，请写出实验思路：                                                                       (2)乙醇是酵母菌的发酵产物。

发酵时酵母菌直接利用的乙醇是酵母菌的发酵产物发酵时酵母菌直接利用的物质是物质是                                                  4)发酵时乙醇浓度升高会对酵母菌产生毒性，从而影响发酵时乙醇浓度升高会对酵母菌产生毒性，从而影响进一步的发酵科学家利用基因工程方法创造出一种对进一步的发酵科学家利用基因工程方法创造出一种对乙醇浓度有高耐受力的酵母菌新菌种，该过程需采用乙醇浓度有高耐受力的酵母菌新菌种，该过程需采用PCR技术扩增目的基因与体内技术扩增目的基因与体内DNA复制相比，复制相比，PCR反反应体系除需加入两种引物外，还需加入应体系除需加入两种引物外，还需加入_____________________________________                     刚果红刚果红涂布平板法涂布平板法透明圈透明圈向定量纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，向定量纤维素分解菌培养液中加入定量纤维素，定时测定葡萄糖产量的变化定时测定葡萄糖产量的变化葡萄糖葡萄糖(或纤维素酶解产物或纤维素酶解产物)耐热的耐热的DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA聚合酶聚合酶)。