纤维素酶酶活测定.doc

纤维素酶活测定方法一、 原理纤维素酶能将纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖，具有还原性末端的纤维二糖糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可与 DNS 试剂发生显色反应反应颜色强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖量又与反应液中的纤维素酶的活力成正比酶活定义纤维素酶活力单位是指 55℃、pH5.0 的条件下，以每分钟催化羧甲基纤维素钠水解生成 1μmol 还原糖所需的酶量定义为一个酶活力单位 U二、实验试剂羧甲基纤维素钠（聚合度 1700-2000），内切纤维素酶（苏柯汉）50mmol NaAC-HAC、DNS 试剂三、实验仪器容量瓶（1000ml ×2、500 ml×3、100 ml ×4、 50ml×4 ml）、移液器、烧杯（500ml×3、50ml×3）、具塞试管、电热套、水浴锅、分光光度计、pH计、电子天平四、标准曲线的绘制表 1、葡萄糖标准曲线管号 0 1 2 3 4 5 6葡萄糖溶液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2蒸馏水（ml） 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8DNS 2 2 2 2 2 2 2摇匀，沸水浴 5min，定容至 25ml，测 OD540nmOD540nm以葡萄糖含量为横坐标，以吸光度 OD540nm 为纵坐标，做标准曲线。

五、酶活测定由于苏柯汉给定的 pH 范围为 4.8-5.2，故选用 pH 5.0 的 50mmol NaAC-HAC 缓冲液测定纤维素酶酶活1、样品的制备CMC-Na 溶液的制备：用 pH 5.0 的 50mmol NaAC-HAC 缓冲液配置 0.5%的 CMC-Na（羧甲基纤维素钠）溶液，准确称量 CMC-Na 0.05g，精确至 0.001g，溶于蒸馏水中，45℃水浴锅中搅拌溶解，冷却后定容至 100ml纤维素酶液的制备：准确称取纤维素酶，精确到 0.001g用 50mmol NaAC-HAC pH5.0 的缓冲液配置成适当的浓度 10000 倍，保证吸光度在 0.2-0.6 之间2、DNS 法测酶活：取 1.8ml 0.5% CMC-Na 的溶液于 25ml 具塞刻度试管中，55℃预热 10min 左右，加入 0.2ml 适当稀释的酶液，于 55℃水浴锅中保温 30min 后，然后加 2ml DNS，混匀，沸水浴 5min，冷却至室温，定容到 25ml混匀测 OD540nm空白对照用酶活的酶液作对照3、结果计算纤维素酶活力（U/g）=r×Df×1000/180.2/t式中：r：通过 OD540nm 值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度（μg/ml）；180.2：木糖的相对分子量，g/mol；t：酶解反应时间，min；Df：稀释倍数：酶活力的计算值要保留三位有效数字。

苏柯汉公司给定的酶活计算公式为：纤维素酶活力（U/g）=r×Df×2×1000/V式中：r：通过 OD540nm 值从标准曲线上查得与标准葡萄糖溶液相对应的浓度（μg/ml）；V：实验时移取的酶液体积，0.2ml；2：时间换算，30min 的倒数为 2；Df：稀释倍数：酶活力的计算值要保留三位有效数字六、最适温度在最适 pH 的条件下，选择一系列温度梯度，分别在30、40、45、50、55、60、65、70、℃下按酶活测定方法测定酶活，确定最适温度七、温度稳定性在最适 pH 条件下，将纤维素酶溶液在一系列温度梯度中保温 72h，前 6 h 每小时测一次酶活，6-10h 每 2h 测一次，之后 12h 测一次看纤维素酶活变化纤维素酶的分离纯化一、实验试剂：NaAC、 HAC、NaCl二、 实验方法（一）纤维素酶的分离纯化1、 上样缓冲液：0.05mol/L 的 NaAC-HAC，PH5.0；梯度洗脱液为含 0.1,0.2, 1.0mol/L 的 NaCl 梯度的上样缓冲液2、 将买的纤维素酶用缓冲液配成 1%浓度的溶液3、 用 3 倍床体积的上样缓冲液平衡柱子，流速 0.5mol/min，上样 40ml，洗涤 2-3 个柱体积后开始进行梯度洗脱，收集各组分。

4、 将各收集组分超滤脱盐，浓缩，是浓缩电导率在 40uS/cm 以下5、 真空冷冻干燥：脱盐后的浓缩液经真空冷冻机干燥备用二）、HPLC 木聚糖酶纯度将分离纯化后的木聚糖酶经 HPLC 检测其组分、纯度醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.6) 取醋酸钠 5.1g,加冰醋酸 20ml，再加水稀释至 250ml,即得 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.7) 　 取无水醋酸钠 20g,加水 300ml 溶解后，加溴酚蓝指示液 1ml 及冰醋酸 60～80ml，至溶液从 蓝色转变为纯绿色，再加水稀释至 1000ml，即得 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH3.8) 　 取 2mol/L 醋酸钠溶液 13ml 与 2mol/L 醋酸溶液 87ml,加每 1ml 含铜 1mg 的硫酸铜溶液 0.5ml,再加水稀释至 1000ml，即得醋酸－醋酸钠缓冲液(pH4.5) 取醋酸钠 18g,加冰醋酸 9.8ml,再加水稀释至 1000ml,即得 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH4.6) 取醋酸钠 5.4g,加水 50ml 使溶解，用冰醋酸调节 pH 值至 4.6，再加水稀释至 100ml，即得 醋酸－醋酸钠缓冲液(pH6.0) 取醋酸钠 54.6g，加 1mol/L 醋酸溶液 20ml 溶解后，加水稀释至 500ml，即得。