Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析).pdf

Real-time PCRXiao Jin Applied SpecialistMolecular & Cellular BiologyReal-time PCR 原理数学原理化学原理Real-time PCR 应用绝对定量相对定量等位基因分型阴阳性判定microRNA荧光定量PCR数学原理基线 阈值 Ct值 [DNA]0同时扩增96的相同样品的结果由于PCR扩增效率的差异使得相同的样品扩增结果存在很大的差异扩增曲线：四个阶段线性图谱对数图谱平台期线性增长期基线期指数增长期平台期线性增长期基线期指数增长期什么是基线？基线就是扩增曲线中的水平部分对数图谱线性图谱基线 阈值 Ct值 [DNA]01. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的2. 偶然误差的结果满足对数分布3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 104. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－55. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR 的扩增使得荧光强度得以测量什么是阈值？基线 阈值 Ct值 [DNA]0基线 阈值 Ct值 [DNA]0什么是CT值？从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数CT值对数图谱CT值线性图谱lg [DNA]循环数线性期y = x(1+e)n指数期为什么CT值∝ [DNA]0 ？N = N0x (1+e)nN：产物分子数； N0：起始分子数e： 扩增效率； n: 循环次数PCR理论方程只在指数期成立为什么CT值 ∝ [DNA]0 ？第 n次 PCR循环时的荧光信号强度 (Rn)等于背景信号强度 (RB)加上每个分子的荧光强度 (即单位荧光强度， RS)与分子数目的乘积。

Rn= RB+ X0(1+ e)n RsRCT= RB+ X0(1+ e)CT Rslg (RCT -RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg RsCT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT -RB) –lgRs设n=CT，则：)1log(log)log()1log(logXSBTXOTERRREXC+−−++−=即CT = - k lg X0+ b （线性方程）标准曲线：CT值对[DNA]0作图CT值lg [起始 DNA]CT = - k lgX0+ b成功的定量PCR荧光定量PCR化学原理SYBR Green I作用机理1. 每形成一个DNA双链，就有一定数量的染料结合上去2. 染料一结合，就产生荧光信号3. 信号强度与 DNA分子总数目成正比数量关系TaqMan探针的FRETTaqMan®ProbeEER QEERQTaqMan作用机理1. 每产生一条DNA链，就切断一条探针2. 每切断一条探针，就产生一个单位信号3. 信号强度与 结合探针的DNA分子数成正比数量关系5’TaqMan探针上游引物3’3’5’下游引物RQ3’5’3’5’QRReal-time PCR 应用• 绝对定量(Absolute Quantification，AQ)• 病原体检测• 转基因食品检测• 基因表达研究• 相对定量(Relative Quantification ， RQ)• 基因在不同组织中的表达差异• 药物疗效考核• 耐药性研究• 等位基因分型(Allelic Discrimination，AD)• 基因突变分析•SNP研究• 物种鉴定、菌株鉴定• 阴性阳性鉴定(Plus/Minus with IPC ，+/-)实时PCR分析实时 分析绝对定量绝对定量相对定量相对定量根据标准曲线提供数量测量提供精确的起始材料相对数量差异绝对定量与相对定量的定义• 绝对定量分析用于确定未知样本中某个核酸序列的 绝对量值，即通常所说的拷贝数。

• 相对定量用于测定一个测试样本中目标核酸序列与校正样本中同一序列表达的 相对变化校正样本可以是一个未经处理的对照或者是在一个时程研究中处于零时的样本Log copy numberCt valuesCt‘s01234567The well contains 400 target copiesY= mx+b绝对定量：从荧光到拷贝数相对定量：参照因子 Calibratort =0t=12 t=24 t=48timetotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNA用以比较结果的基准相对定量：内对照 Endogenous Controlt =0t=12 t=24 t=48timetotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNAtotal RNAcDNA用以标准化样品操作IL-2 18S ΔCtΔΔCt2-ΔΔCtT=0 (calibrator) 24 9 15 0 1.0T=1hr 24 10 14 -1 2.0T=6hr 23 11 12 -3 8.0T=24hr 28 10 18 3 0.10246810Relative Quantityof Expression2.08.01t = 0t = 1 ht = 6 ht = 24 h0.1相对定量研究软件• 同时分析多达 10块反应板的基因表达数据– 多至960 个数据点的单击分析– 数据直观• 通过ΔΔ CT(比较 Ct)法完全自动分析数据• 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出终点检测终点检测阴性阳性鉴定阴性阳性鉴定等位基因分型等位基因分型目标序列的有无突变的存在形式等位基因分型• 定义：等位基因分型 (AD)分析是一种 多重 （每个反应包括一个以上的引物和探针对）、终点 （在 PCR过程的终点收集数据）分析实验，用于检测某个核酸序列的 变异 。

• 每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性（ SNP）位点上出现两个可能的变异基因型• 目标序列的实际量不确定正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测基因分型检测FAMVICHomozygote for FAM-specific alleleFAMVICHomozygote for VIC-specific alleleFAMVICHeterozygote forboth alleles 等位基因自动识别软件• 加速数据分析• 等位基因分组识别• 每一个孔的质量评分• 用户自定义的质量评分标准• 基于每一个标记的识别• 限制用户的主观干扰阴性阳性鉴定• 定义：阳性/ 阴性实验是一种 终点 分析，它可以确定某个样本中 是（阳性，用加号表示）否 （阴性，用减号表示）存在一个特异性目标序列在终点分析中，数据是在 PCR过程结束时获得的• 什么是 IPC？IPC 是一种 阳性内对照 ，它被用在阳性/ 阴性实验中，用于监测 PCR过程并确定阴性结果不是因为 PCR失败而造成IPC 包括一个模板、一组引物和一个荧光标记（ VIC）的探针，被加到反应板的每一个孔中阴性结果示例阳性结果示例microRNA• MicroRNA(miRNA)是一种22个碱基左右的内源性单链小分子RNA• 由带茎环结构的双链RNA 前体剪切而成• 具有高度保守性、时序性和组织特异性• 通过与特异mRNA 结合，抑制目标基因表达或降解mRNAmiRNA Expression1. Transcription2. Hairpin release in the nucleus3. Export to cytoplasm4. Dicer processing5. Strand selection by RISC6. Translational repression*mature active strandMechanisms of Small RNA-Induced Gene Regulation为何研究miRNA ？•miRNA已被确认为一类新的基因调控因子，参与了细胞的发育、分化和联络• 对miRNA功能的研究将有助于设计 siRNA干扰实验•miRNA有可能成为新的生物分子标记• 有重要的临床应用价值miRNA 分析的技术挑战Northern Blot (杂交法 )• Homegrown technology and easy to access (易于操作)• Large sample amount requirement (ug scale) (需大量样品)• Low dynamic range (two orders of magnitude) (可测范围低)• Mismatch hybridization often cannot distinguish well between miRNAsthat only have small sequence differences (错配杂交问题 )Microarrays (芯片法 )• High throughput (高产出 )• Improved dynamic range (可测范围较宽)• Large sample RNA requirement, approximately 5 µg per array (需大量样品)• Difficult or impossible to distinguish between the Pre-miRNA and miRNA(很难区分前体miRNA and 成熟 miRNA)• Do not distinguish well between miRNAs that have only small differences in sequence. (对类似结构的miRNA 分辨率差)Quantitative Real-Time PCR (实时定量PCR)• Dramatically less sample requirement (只需微量样品)• Significantly wide dynamic range (7 logs) (非常宽的可测范围)• High sensitivity and specificity (高灵敏度, 高特异性)• However, how to design a TaqMan real-time PCR assay on a ~22 base polynucleotide fragment? (但是, 如何设计这样一个靶物只有22个碱基TaqMan real-time PCR?)Solution: TaqMan®MicroRNA PCR AssaysPrecursor miRNAMature miRNAWorkflow mirVana™ miRNA Isolation KitTaqMan®MicroRNA RT kitTaqMan®MicroRNA AssaysTaqMan®Universal Master Mix,No UNGFive Fully Integrated Systems for Real-Time PCRApplied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR SystemApplied Biosystems 7300 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems 7500 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems StepOne™Real-Time PCR SystemmirVana™ miR。