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微生物突变变体 的获获得方法 Homelabel 来源：生物技术通报 2010年第2期 构建微生物突变体的方法综 述 张念章 逯忠新 突变体的获得方法课件 突 变 体 什么是突变变体？ 定义1： 一般指带 有已经发生突变的基因的细胞、 病毒或细菌，有时也指发生突变 的基因 定义2： 携带 突变基因的细胞或个体 (mutant) Homelabel 突变体的获得方法课件 物 理 方 法 基 因 工 程 化 学 方 法 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 物物 理理 方方 法法 1.紫外 2.电离辐射 3.离子注入 4.微波 5.其它 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 紫 外 紫外线线是诱发诱发 微生物突变变的一种非常有用的工具 DNA和RNA的嘌呤和嘧啶嘧啶 有很强的紫外吸收能力，最大的吸 收峰在260 nm 因此，波长长在200-300 nm的紫外光才有诱变诱变 作 用紫外线线可引起生物体形成嘧啶嘧啶 (主要是胸腺嘧啶嘧啶 )二聚体 、嘧啶嘧啶 水 合物和引起DNA分子交联联 其中形成嘧啶嘧啶 二聚体的生物学效应应研究的比较较清 楚由于二聚体的出现现会减弱双链间氢键链间氢键 的作用，引起双链链 结结构扭曲变变形。

同时时又会妨碍双链链的解开，阻碍碱基正常的互补补配对对，影响 DNA的复制和转录转录 ，从而导导致突变变或死亡 尽管不断有新型的诱变诱变 技术产术产 生，紫外诱变诱变 技术术 因其操作简单简单 ，效果显显著，在很多领领域仍然发挥发挥 重要作用 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 电离辐射是指一切能引起物质产生电离作 用的辐射总称生物学上常用射线进行辐射，此外还有 射线、射线和快中子等这些射线可直接将能量传递 给生物分子，使细胞中有序排列的生物大分子处于激发 和电离状态引起遗传物质的变化主要是碱基的氧化作 用，糖苷键及DNA单链键 或双链键断裂伴随着生物大分 子化学键的断裂，有机体内产生大量的离子和自由基这 些自由基与细胞中的溶质分子相互作用，诱发酶的释放 ，导致代谢的方向性和协调性紊乱，促使开始的生物化 学损伤进 一步发展，引起了机体内环境的进一步变化 电离辐射电离辐射 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 离子注入技术最早用于农作物育种，近几年来因其在 微生物诱变育种中的高效性，得到了越来越广泛的应用 离子注入生物体内会在动量、能量和 质量的三重作用下产生不同的生物学效应。

因此，与 生物体的相互作用存在峰值，在峰值范围内，注入离子与 生物体的相互作用是局部的、双重的和不易修复的 在离子注入过程中，生物分子将会吸收能量，经历复 杂的物理和化学的变化，产生各类自由基这些活性自由 基，不但可以引起正常生物分子的损伤，致使细胞中的染 色体畸变，DNA链断裂，也可使质粒DNA形成断裂点产 生染色体重复、易位、倒位，碱基缺失等多种生物学效应 离子注入技术与目前其它的诱变源相比，具有LET值高， 射程可控，集束性好，能量沉积和质量沉积区域集中等优 点，在不同的作物及菌种的诱变育种中发挥出巨大的作用. 离子注入技术 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 微波辐射属于一种非电离性高频电磁波，在300 MHz 一300 GHz范围内有较强的生物效应，主要对生物体产生 热效应和非热效应在微波作用下，生物体会产生局部温 度上升(热效应)以及非温度关联的各生理生化反应(非热效 应)，进而产生一系列突变效应 除上述的方法之外，还有利用其它物理因素进行的诱变，如利用激光、太 空条件等，或多种方法联合使用构建生物突变体 微波辐射 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 化学 诱变诱变 方式 1.烷化剂 2.其它诱变剂及复合诱变 Homelabel 0.化学诱变 backback 突变体的获得方法课件 化学诱变剂是一类能和DNA起作用 ，进而改变DNA的空间结构或者结构组 成，导致DNA产生变异的物质。

按其诱 变机制可分为碱基类似物诱变剂、直接 诱变DNA结构的诱变剂和诱发移码突变 的诱变剂3类利用化学诱变剂进行的化 学诱变具有使用方便，特异性较强和诱 变后代较易稳定遗传等特点 该方法已培育出许多具有生产 利用价值的微生物新品种，给生产带来 了巨大的经济效益和社会效益. Homelabel backback 突变体的获得方法课件 烷化剂又称生物烷化剂，是一类能形成碳正离子或其它亲 电性基团的化合物常用的烷化剂包括亚硝基胍(NTG)、甲基磺 酸乙酯(EMS)、硫酸二乙醋(DMS)和硫酸二乙酯(DES)其中Ems 是目前公认的效果最好和应用最广的一种化学诱变剂其诱变 作用主要发生在鸟嘌呤N7位置上，烷基取代H离子后，使之 成为一个带正电的季铵基团，从而发生两种遗传效应：一是烷 化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，代替胞嘧啶，发生转换突变(即G ：C变为A：T)；二是由于鸟嘌呤的N-7烷基活化，糖苷键断裂 造成脱嘌呤，鸟嘌呤的位置成了一个空位，复制时其互补位置 上的碱基就不受严格的配对限制，4种碱基都有机会进入，从而 造成置换现象此外，EMS还可以造成糖磷酸骨架断裂，引 起染色体缺失与其它诱变剂相比，EMS诱变后产生的突变频 率高，且多为显性突变体，易于突变体的筛选。

烷化剂烷化剂 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 除了烷化剂外，平阳霉素(PYM)、秋水仙素、5-溴尿 嘧啶(5-BU)、2-氨基嘌呤(AP)等也常用于诱变工作 其它诱变剂诱变剂 及复合诱变诱变 将两种或多种诱变剂的联合应用于突变育种工作中 就形成了复合诱变该诱变过程包括：两种或多种诱变剂 的先后使用；两种或多种诱变剂的同时使用；同一种诱变 剂的交替重复作用等普遍认为，如果将两种或两种以上 诱变剂合理搭配使用，诱变剂间的协同效应会产生较单一 诱变更好的效果 以一株绿色木霉F1为出发菌株，经紫外线、亚硝基胍 、硫酸二乙酯三种因素依次处理，以每一轮诱变处理筛选 到的酶活最高的突变株作为下一轮诱变的出发菌株 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 基因工程方法基因工程方法: : 1.DNA标签法 2.基于载体构建的突变体 3.基因打靶技术 4.RNA干扰技术 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 当一段特定的DNA序列插入到基因组目的因的内部或 其附近位点时，便会诱发该基因发生突变，形成突变体 根据这一作用原理，用已知的插入DNA分子做探针， 发展出来一种分离未知基因的方法。

由于插入的DNA序列， 相当于人为的给目的基因加上一段已知的序列标签，因此称 DNA插入突变分离基因的技术为DNA标签法，亦叫基因标 签法 它包括TDNA标签法和转位子标签法两大类其中转 位子标签法又可分为同源转位子标签法和异源转位标签法 基因标签法基因标签法 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 常用的构建突变体的载体包括质粒载体、噬菌体载体以 及二者部分结构组合成的噬菌粒载体细菌质粒是存在于细 胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份，可以持 续稳定的处于染色体外的游离状态人们利用质粒转移技术 打破物种界限，赋予生物新的遗传性状，使外源基因在受体 细胞内按照人们期望的方式进行表达，并进行基因功能分析 等研究与质粒相似，噬菌体也可作为外源基因表达的载体 最常用的噬茵体载体是入噬菌体载体 根据使该载体失活的方法，又可以分为插人型载体和替 换型载体利用入噬菌体实现基因克隆和表达的有DNA连接 酶、DNA聚合酶I等由部分质粒载体和部分单链噬菌粒载体 组合而成的具有双功能的新型大肠杆菌克隆载体系列，就形 成了噬菌粒载体它有两个复制起点，其一来自ColEl，其二 来自单链噬菌体。

此载体具有分子量小、克隆能力大、可遗 传稳定等优点基于载体构建微生物突变株，特别是用质粒 为载体，是目前在基因工程中应用较多的构建突变体的方法 基于载体构建的突变体基于载体构建的突变体 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 20世纪80年代后期发展的基因打靶技术，通过在转染细胞 中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重组， 真正实现了外源基因定点整合到基因组特定位置上的目的，从而 可以有针对性的改变细胞的遗传特性基因打靶的分子基础是两 条具有相同或类似核苷酸序列的同源DNA分子之间发生的遗传信 息的重组事件因此，基因打靶需要首先将要整合到受体细胞核 基因组目标座位的外源打靶基因，以及位于打靶基因两侧与内源 目标基因同源的DNA片段，克隆在具有选择性标记基因的载体( 如自杀性质粒载体)上，构成专用的基因打靶载体之后再将其 转化进感受态的受体细胞由于外源打靶基因的两侧与内源核基 因组上的目标基因或座位之间存在着同源的DNA序列，两条DNA 链的相同部分便会相继发生单链断裂、链的交换、磷酸二酯键的 形成和缺口重新封闭等一系列变化，并最终完成同源重组，实现 外源基因在核基因组DNA上的定点组合。

基因打靶的效率取决于 DNA同源重组的频率，这与两条重组DNA分子之间的同源序列的 长度密切相关现在，该技术在检测基因功能、治疗遗传疾病等 方面有着研究与应用 基因打靶技术 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 20世纪90年代发现的RNA干扰(简称RNAi)现象也可以高效而特意的阻断 体内相应基因的活性，发挥基因剔除的作用 RNAi引起基因沉默的大致过程是外源性的dsRNA在Dicer酶的切割下形 成2125 bp的siRNA该siRNA便会同RNA诱导的沉默复合体(RNA- induced silencing complex，RISC)结合，并将其激活激活状态的RISC催 化ds-siRNA发生解旋和解链其中的反义链会附着在RISC表面与mRNA配对 ，形成新的siRNA，再循环作用于另外靶的向mRNA另一条链会被释放分 解这种不断放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA，使siRNA在短时间内 迅速有效的抑制mRNA翻译，从而有抑制靶向基因蛋白或多肽的合成内源 性的mRNA会因存在反向重复序列而形成发卡结构的miRNA，也会产生RNAi 其过程与siRNA形成RNAi的过程虽有差别但大致相同。

现已发现在真菌等 绝大多数真核生物中都有RNAi现象的发生人类应用RNAi技术，必将带来 操控生物性状改变的新的革命 RNARNA干扰技术干扰技术 Homelabel backback 突变体的获得方法课件 。