免疫组织化学步骤详解.pdf

免疫组织化学技术取材将小鼠麻醉， 打开胸腔充分暴露心脏，在心尖处剪一个小口，将注射器针头经小口送入左心室并插至升主动脉起始部，用线将针头固定，剪破右心耳，灌注50ml 生理盐水随后缓缓注入150ml 4% 多聚甲醛（ pH7.4） ，固定 1h 后将脑取出，浸于4% 的多聚甲醛中放入4℃冰箱内固定12h，然后转入30% 的蔗糖溶液中浸泡48h石蜡包埋1. 取出皮层及海马，流水冲洗24h，用梯度浓度的酒精进行脱水，酒精浓度梯度为70%酒精→ 80% 酒精→ 90% 酒精，各 30min，95% 酒精Ⅰ→ 95% 酒精Ⅱ， 各 20min，100% 酒精Ⅰ→ 100%酒精Ⅱ，各15min2. 取出皮层及海马，浸入到二甲苯中透明，1h×2 次3. 取出皮层及海马，浸入到二甲苯与石蜡1:1 混合液中，浸泡1 小时4. 取出皮层及海马，浸入到石蜡中，浸泡1 小时× 2 次5. 在石蜡包埋机上进行组织包埋，冷却后保存在4℃冰箱中备用切片将组织用石蜡切片及进行切片，切片厚度为2μm 连续切片5 次，取 1 张切片，水浴锅展片后贴附在多聚赖氨酸包被的载玻片上每个组织取5 张切片所有切片在烤箱中60℃烤片 2h。

脱蜡及水化 (48min) 1.切片在二甲苯中脱蜡10min×2 次2.切片在梯度浓度酒精中水化，酒精梯度浓度为100%酒精Ⅰ→ 100%酒精Ⅱ→ 95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ，各5min，90%酒精→ 80%酒精，各3min，70%酒精， 2min3.最后蒸馏水中浸泡1min灭活内源性的过氧化物酶(40min) 1.用 0.01M PBS 冲洗 3 次，每次5min 2.滴加 3%H2O2(先用现配 )到切片上，孵育10 分钟3.切片用 0.01M PBS 洗 5 分钟× 3 次抗原修复(70min) 1.将事先配制好的抗原修复液在水浴锅中加热到95℃2.将切片浸入到0.01M 的柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）修复液中，进行抗原修复15 分钟 3.修复后，取出切片，室温下冷却复温 40 分钟 4.切片用 0.01M PBS 洗 5 分钟× 3 次膜打孔 (25min) 1.滴加 0.3% TritonX-100( 曲拉通，现用现配)到组织片上，室温下孵育10 分钟2.切片用 0.01M PBS 洗 5 分钟× 3 次封闭 (20min) 1.滴加 10% BSA 至组织片，室温下孵育20 分钟。

2.倾去 BSA，勿洗免疫反应1.滴加一抗至组织片上用于 DAB 显色的组织片一抗浓度为 1:500，用于免疫荧光的组织片一抗浓度为1:20002.组织片 4℃孵育过夜3.第二天取出组织片，室温下复温1h4.组织片用0.01M PBS 洗 5min×3 次5.滴加二抗，用于DAB 显色的组织片滴加山羊抗兔辣根过氧化物酶标记的二抗，浓度为 0.4:250；用于免疫荧光的组织片滴加山羊抗兔FITC 标记的二抗，浓度为1:1506.滴加二抗后，酶标组织片室温下孵育一个小时 ，用 0.01M PBS 洗 5 分钟× 3 次，进行后续实验步骤FITC 标记组织片室温下孵育 30 分钟 ，缓冲甘油 封片，镜检显色滴加 DAB 显色液，光镜下显色， 待颜色满意后， 自来水冲洗终止显色，冲洗时间5min苏木素复染组织片浸入苏木素染液染色2min，自来水冲洗1min，取出后 1%盐酸酒精分化10s，自来水冲洗2min，氨水返蓝15s，双蒸水冲洗1min封片将切片依次浸入70% 、80% 和 90% 的梯度酒精中各2min，随后浸入2 次 95% 的酒精和2次无水乙醇中各3min接着浸2 次二甲苯，每次5min。

最后用 树胶 封片普通： 在载玻片组织上滴一滴封片液，然后使盖玻片倾斜，一侧先接触液体，缓慢盖在组织上，避免其产生气泡荧光：用荧光封片剂封片，不能滴太多，放盖玻片的时候避免气泡，尤其组织周围然后用中性树胶滴盖玻片的四角，少滴30min 后放锡纸盒中，冰箱四度保存免疫组织化学配方0.1M PBS：NaH2PO4 · 2H2O 15.5g ，Na2HPO4 · 12H2O 6g，NaCl 87.75g ，双蒸水溶解后调 pH至 7.2 ，用双蒸水定容至1L0.01M PBS：用双蒸水将0.1M PBS 稀释 10 倍4% 多聚甲醛磷酸缓冲液：40g 多聚甲醛和500ml 0.1M PBS 混匀后加热至60℃，搅拌并滴加 1N NaOH至溶液清晰为止，冷却后用0.1M PBS 定容至 1000ml3%H2O2 ：30%H2O2 100 μl 与 0.01M PBS 900 μ l 混匀现用现配Tris-EDTA 抗原修复液：将Tris碱 1.21g ，EDTA 0.37g 溶于双蒸水，调pH至 9.0 ，加入吐温 -20 500 μl ，双蒸水定容至1000ml10%BSA ：10g BSA 溶于 100ml 0.01M PBS 中。

0.3% Triton X-100 曲拉通 : Triton X-100 3μl 同 0.01M PBS 997μ l 混匀现用现配盐酸酒精： 1ml 盐酸同 99ml 75%的酒精混匀抗原修复液（柠檬酸钠缓冲液）（10mM柠檬酸钠， 0.05%吐温 20，PH6.0）的配方：柠檬酸钠（ 2H2O2 ）2.94g ，双蒸水溶解，用1mol/L 的盐酸调PH至 6.0 ，加 500μl 吐温 20，定容到 1L，室温下可保存3个月。