NogoA在脑缺血再灌注白质损伤中的表达及其意义临床医学论文.doc

NogoA在脑缺血再灌注白质损伤中的表达及其意义_临床医学论文 作者：高晓玉 王得新 张拥波【摘要】 目的 检测脑缺血再灌注后不同时间点轴突生长抑制因子NogoA在损伤白质区的基因表达，探讨NogoA与缺血再灌注白质损伤的可能关系方法 制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注(MCAO)模型，实时定量聚合酶链反应方法(Relative Quantification PCR,RQPCR)检测各时间点NogoA在损伤白质区域的基因表达结果 在损伤白质区域，NogoA基因表达在缺血再灌注1 d时表达量开始减少(与假手术组相比，P<0.05)，7 d时降至最低，14～21 d表达量开始上调，21 d时仍低于假手术组水平(与假手术组相比，P<0.001)结论 缺血再灌注损伤后白质区域的NogoA基因表达呈现动态变化 规律 ，针对NogoA进行干预有望为缺血再灌注损伤后的脑保护 治疗 找到新的靶点 【关键词】 脑缺血; NogoA;白质损伤　　【Abstract】 Objective To study the expression of NogoA in cerebral white matter after focal cerebral ischemiareperfusion(I/R) in rats, and explore the relationship between NogoA and cerebral white matter lesions after ischemia. Methods SpragueDawley male rats were subjected to 2 h of middle cerebral artery occlusion (MCAO). Relative quantification PCR(RQPCR) was performed to examine the expressions of NogoA gene at different reperfusion time. Results The expression level of NogoA gene in the white matter was decreased in 1 d group(P<0.05 vs sham group),and was the weakest in 7 d group. It was increased in 14～21 d group, and in 21 d the expression level was still lower than that of sham group(P<0.001). Conclusions NogoA expreesion has dynamic changes in the white matter after focal cerebral I/R. NogoA could be as one of the targets for neuroprotective therapy after cerebral ischemia.　　【Key words】 Cerebral ischemia; NogoA; White matter lesion　 2000年,Chen等人克隆出大鼠和人类抑制受损轴突再生的基因NogoA基因〔1～3〕。

这一基因广泛存在于中枢神经系统神经元和少突胶质细胞中,NogoA蛋白与NogoA基因分布一致〔4〕中枢神经损伤后NogoA蛋白与p75NTRNgR受体复合物结合,发挥抑制神经再生的作用〔5〕给大脑中动脉栓塞(MCAO)大鼠注射抗NogoA的单克隆抗体中和其作用,可以使轴突分支及树状棘的密度增加,即使给正常大鼠注射,也能产生短暂的轴突过度生长的现象〔6〕这说明NogoA在一定程度上可以限制轴突再生NogoA的发现,为中枢神经系统的损伤修复带来了新的希望而目前有关NogoA与缺血再灌注白质损伤的关系并不清楚本实验利用大鼠MCAO模型，观察再灌注损伤后NogoA基因在损伤白质区域表达的时空变化规律，以探讨NogoA与缺血性脑白质损伤的可能关系　　 1 材料与方法 　　1.1 动物 成年健康雄性Sprague Dawley大鼠48只，SPF级，体重250～280 g购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物自由进食进水　　1.2 大脑中动脉阻塞(MCAO)模型的制备 动物房12 h光暗交替，55%相对湿度，温度22℃动物适应环境1 w后开始实验应用线栓法建立右侧MCAO模型〔7，8〕。

随机分为缺血120 min再灌流6、12 h、1、3、7、14、21 d组，每组6只，用于实时定量聚合酶链反应(RQPCR)的检测另取6只作为假手术组，假手术组除插线长度为15 mm外，余步骤同实验组参照Zea Longa 5分制评分标准〔8〕,待大鼠麻醉清醒后进行评分，剔除评分为0分或4分的大鼠每组大鼠在规定的时间点取材，假手术组于手术后1 d取材以10%水合氯醛(0.6 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，立刻断头，冰上取右脑，切去距离额极、枕极各2 mm的脑组织，剩余部分分离出白质区域后液氮速冻后-80℃冻存，用于RQPCR检测 　　1.3 RQPCR检测NogoA基因 用Prime 5.0软件设计引物,由大连宝生物公司合成NogoA：F：CTGCTGCATCTGAGCCTGTGATA;R：AGGCAGCAGTTTCAAGCAGGA，扩增产物为126 bpGAPDH为大连宝生物公司试剂，扩增产物为133 bp引物设计后通过BLAST分析(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)避免扩增的序列存在非特异性，用oligo demo软件测试序列无引物二聚体形成实验步骤如下：RNAprep动物组织总RNA提取试剂盒(Tiangen Biotech CO,LTD)提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳，鉴定提取RNA质量，采用ProtoScriptTM第一链cDNA合成试剂盒( 购自New England BioLabs)将总RNA逆转录为cDNA，然后将PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳后于紫外透射仪上观察并照相。

最后采用 SYBR PQPCR检测(SYBR green PCR master mix 购自 Applied Biosystems，USA)：RQPCR在96孔聚丙烯反应板上、置于实时PCR仪上进行，每个样品均重复3次按以下反应体系进行：2×SYBR Green master mix 10 μl， 上游引物0.25 μl，下游引物0.25 μl，模板1 μl，加不含RNA酶的水至反应体系为20 μl，短暂离心后进行扩增，反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min后两步共进行50次反应结束后，进行熔解曲线分析，反应条件为95℃ 15 s， 60℃ 20 s，95℃ 15 s，全部反应结束后，由电脑自动分析并 计算 结果　　1.4 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件，所有数据均以x±s表示，采用方差分析比较各组变量的差异　 　2 结 果 　　NogoA基因表达于缺血再灌注1 d时降至假手术组的84%(P<0.05)，7 d时降至最低点，为假手术组的30%，14～21 d时表达量开始上调，21 d时表达量上调至假手术组的66%(P<0.001)，但仍明显低于假手术组。