新景质粒dna小量试剂盒说明书.pdf

Simgen PlasmidDNA Mini Kit 09/20101 产品组成产品组成 质粒 DNA 小量试剂盒 Cat. No. 5 次样品 1001005 50 次产品 1001050 核酸纯化柱 2 ml 离心管 中和指示剂 RNase A Buffer I Buffer II Buffer III Buffer W1 Buffer W2（浓缩液） Buffer E 说明书 5 个 5 个 20 μl * 1.5 ml 1.5 ml 2 ml 3 ml 2 ml 0.6 ml 1 份 50 个 50 个 150 μl 28 μl 14 ml 14 ml 20 ml 28 ml 16 ml 6 ml 1 份 * 样品中的 RNase A 已加入到 Buffer I中 产品储存与有效期产品储存与有效期 1． RNase A 请于-20℃保存 2． 加入 RNase A 的 Buffer I请于 2~8℃储存如果储存时间超过 6 个月，需在 Buffer I中 补加 RNase A 至终浓度为 100 μg/ml。

3． 其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃） ，可在两年内保持使用性能无明显变 化；如果将产品储存于 2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上（2~8℃储存的产品 使用前应先使产品恢复到室温后再使用） 用户需自备的试剂与物品用户需自备的试剂与物品 1. 无水乙醇 2. 1.5ml 离心管、移液器及吸头 3. 一次性乳胶手套等防护用品和纸巾 4. 台式小量离心机（可配离心 1.5ml 离心管和 2ml 离心管的转子） 5. 水浴锅和旋涡振荡器 技术支持技术支持 杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail: technical@, ：0571- 87983751 质量保证质量保证 杭州新景生物试剂开发有限公司保证提供的产品是通过质量检验的合格产品如果 用户在使用中发现产品不能满足实验要求，请立即停止使用产品，并联络我公司技术支 持获取帮助；或者直接联络我公司当地代理商，提出产品更换要求（注意：如果经过鉴 定是因为客户的错误操作所导致的实验失败，我公司只能提供相应的补救措施，保留不 予更换的权利） 2 Simgen PlasmidDNAMini Kit 09/2010注意事项注意事项 Buffer II、Buffer III和Buffer W1均含刺激性化合物，操作时请戴乳胶手套和防护眼 镜，避免沾染皮肤、眼睛，谨防吸入口鼻。

若沾染皮肤、眼睛时，须立即用大量清水或 生理盐水冲洗，必要时请寻求医疗咨询 产品介绍产品介绍 本试剂盒结合了碱裂解法抽提质粒原理及柱纯化核酸技术，可在20－30分钟内从 1～5 ml LB培养基细菌培养物中快速分离纯化多至20 µg高纯度质粒DNA获得的质粒 DNA适用于限制性内切酶消化、测序、文库筛选、连接与转化、体外转录与翻译、强壮 细胞转染等分子生物学实验如果纯化的质粒DNA需要用作较为敏感的细胞转染实验， 请选择超纯质粒DNA中量试剂盒（Cat. No.：1006105） 产品适用的样本范围产品适用的样本范围 本产品适合从革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌）中分离纯化质粒DNA如果需要从革 兰氏阳性细菌中分离纯化质粒DNA，请先用溶菌酶对细菌进行破壁处理，或者电询我公 司技术支持获取帮助 操作步骤分析与说明操作步骤分析与说明 1. 起始样本起始样本 从新鲜培养的平板中挑取一个单克隆菌落，接种到3-5ml 含对应抗生素的LB培养 基中，37°C，剧烈振荡培养12-16小时注意事项如下： 1. 不应吸取储存的甘油菌直接进行培养长时间储存的甘油菌中的细菌可能已经出现 细菌个体间的分化，并混有丢失质粒的细菌。

甘油菌必须在含有抗生素的平板上划 线，挑选生长良好的单菌落用于接种培养 2. 细菌培养时间不应超过16小时培养时间超过16小时的细菌开始出现溶解现象，可 能因此导致质粒DNA的得率降低 3. 用于细菌培养的培养基所占容器的体积不应大于1/4 4. 将LB培养基中的NaCl含量提高到10g/L，每毫升LB细菌培养物的质粒回收效率能提 高2 μg左右 2. 菌体溶解菌体溶解 快速收集的菌体（12000 rpm 离心30秒）通常会堆积得比较紧密而不易悬浮，可以 改用3000 rpm 离心5分钟收集菌体，以便于后续悬浮步骤的操作 必须用Buffer I 充分悬浮细菌，未被悬浮分散的细菌不能被碱性的Buffer II溶解 溶解后的细菌中的质粒DNA与基因组DNA均泄漏出来，处于变性状态 3. 沉淀菌体碎片和基因组沉淀菌体碎片和基因组DNA Buffer III会中和 Buffer II中的碱性物质，此时质粒 DNA 将恢复至超螺旋结构并保留 在溶液中，大片段的基因组 DNA 则在复性的过程中与菌体碎片缠绕在一起而沉淀出 来经过 13000 rpm 离心 10 分钟后基因组 DNA 与菌体碎片聚集到 1.5ml 离心管底部， 与质粒 DNA 分离开来。

Simgen PlasmidDNA Mini Kit 09/20103 4. 中和指示剂中和指示剂 由于细菌的生长条件或者细菌的菌株间的差异，初次使用质粒纯化试剂盒的用户通 常难以把握最佳的中和效果如果事先在 Buffer I 中加入了中和指示剂，加入 Buffer III 后翻转离心管时，沉淀中的蓝色部分会逐渐消失，直至完全转变成淡黄色沉淀，此时即 可判定是充分中和的效果对于初次使用质粒纯化试剂盒的用户或者是从 5ml LB 细菌 培养物中分离纯化质粒的用户，我们强烈推荐使用中和指示剂 5. 柱纯化技术柱纯化技术 1）DNA 结合 1）DNA 结合 将离心获取的含有质粒 DNA 的上清液倒入纯化柱中短时离心数秒，即可使 DNA 吸 附到纯化柱的硅胶膜上，残留的蛋白或者抑制下游分子生物学反应的杂质则被过滤除 去 2）洗涤 2）洗涤 纯化柱上通常会残留少量蛋白，Buffer W1 能有效地洗去这些残留的蛋白 如果从野生型的大肠杆菌或者是非限制性内切酶缺陷型（endA+）的宿主菌的中纯 化质粒 DNA，Buffer W1 洗涤步骤不能省略，残留在纯化柱上的微量蛋白（主要是内源 性的非特异性核酸内切酶Ⅰ）会严重影响后续的酶切反应。

下表是常见宿主菌的 endA 基因型 如果从 DH5α、DH10B 等限制性内切酶缺陷型（endA-）宿主菌中纯化质粒 DNA， Buffer W1 洗涤步骤可以省略但如果从 5ml LB 细菌培养物中分离纯化质粒，残留在纯 化柱上的蛋白会增多，也不应省略 Buffer W1 的洗涤步骤 Buffer W2会洗去残留在膜上的Buffer W1，确保纯净的质粒DNA吸附在纯化柱上 质粒 DNA 结合、洗涤的过程中只需要使溶液滤过纯化柱即可，因此对离心速度和 离心时间并无严格的要求如果使用国产离心机，可以将离心速度改为 8000 rpm 以降 低噪音；如果使用进口离心机，则可以选用离心机中的“short run”或“quick”模式运行 以节约操作时间 3）离心甩干 3）离心甩干 将洗净后的纯化柱放回到 2 ml 离心管中，14000 rpm 空离 1 分钟（如果离心机的离 心速度达不到 14000 rpm，我们建议至少使用 12000-13000 rpm 离心 2 分钟 ）的作用： A．使 Buffer W2 被充分地离心除去 B. 在丢弃 Buffer W2 滤液的过程中，如果有滤液不慎沾染到纯化柱上，也可被离心 除去。

4 Simgen PlasmidDNAMini Kit 09/20104）洗脱质粒 DNA 4）洗脱质粒 DNA A. 我们推荐使用试剂盒中提供的 Buffer E（10 mM Tris-HCl, pH 7.5）洗脱质粒 DNA，以便于质粒 DNA 的长期稳定储存；也可以用去离子水洗脱 DNA，但是应确保去 离子水的 pH 大于 7，否则将影响 DNA 的洗脱效率 B. 增加用于洗脱质粒 DNA 的 Buffer E 或者去离子水的体积可以提高质粒 DNA 的 回收效率；减少洗脱体积可以增加获得的质粒 DNA 的浓度但如果用于洗脱质粒 DNA 的 Buffer E 或者去离子水的体积少于 50 µl，则不能再增加获得质粒 DNA 的浓度，并使 质粒 DNA 的回收效率降低 C. 预热的 Buffer E 或者去离子水能提高质粒 DNA 的洗脱效率 D. 将 Buffer E 或者去离子水加入纯化柱后延长静置的时间（延长至 3-5 分钟）能提 高质粒 DNA 的洗脱效率 E. 离心甩干后的纯化柱可直接加入 Buffer E 洗脱质粒 DNA，无需打开纯化柱盖子 挥发残留的乙醇，过度干燥的纯化柱会不利于质粒 DNA 的洗脱。

F. 为了产品使用的安全，如果离心机没有防泄漏的盖子，我们建议将洗脱质粒 DNA 的条件改为 8000 rpm 离心 1 分钟，以防止 1.5ml 离心管管盖脱落而损伤离心机 5. 质粒质粒DNA的提取效率与纯度的提取效率与纯度 从细菌中提取的质粒 DNA 质量的多少主要取决于菌体中质粒 DNA 的拷贝数，对于 高拷贝质粒，通常从 1.5 ml LB 细菌培养物中能获得 5-15µg 质粒 DNA如果是低拷贝 质粒，我们建议将用于质粒 DNA 提取的 LB 细菌培养物增加至 5 ml，并在 Buffer I加入 中和指示剂确保获得合适的中和效果下表是常见质粒的拷贝数 质粒质粒 Origin of replication Copy number Classification pUC vectors pMB1 500–700 high copy pBluescript vectors ColE1 300–500 high copy pGEM® vectors pMB1 300–400 high copy pTZ vectors pMB1 >1000 high copy pBR322 and derivatives pMB1 15–20 low copy pACYC and derivatives p15A 10–12 low copy pSC101 and derivatives pSC101 ~5 very low copy 质粒 DNA 的质量通常用测量 260 nm 处的光吸收值进行估算。

为了精确估算，260 nm 的吸光值应处于 0.1 至 1.0 之间，因此洗脱的 DNA 如果用于检测 260 nm 的吸光 值，稀释比例不应超过 10 倍 DNA 的纯度通常用 A260/A280 进行估算纯净的 DNA 比值应该在 1.7–1.9 之间， 同样为了确保精确估算 DNA 的纯度，洗脱的 DNA 的稀释比例也不应该超过 10 倍 使用前准备使用前准备 1. 如果离心机有制冷功能，请将温度设置到 25℃ 2. 向装有 RNase A 的螺旋盖管中加入 1ml Buffer I，混匀后再将溶液吸回到装有 Buffer I 的瓶子中，并在标签的方框中打勾作好“RNase A 已加”的标记，置于 2~8℃保存 3. 根据试剂瓶标签上的指示在 Buffer W2 中加入无水乙醇，并在标签的方框中打勾作好 “乙醇已加”的标记 4. 当室温低于 15℃时，使用 Buffer II前应先观察溶液是否有白色沉淀产生，如有沉淀则 应于 37℃水浴直至沉淀溶解后再使用 5. 将装有中和指示剂的螺旋盖管低速离心数秒使溶液沉淀到管底，吸取 140 μl 中和指示 剂加入到 Buffer I中，混合均匀。

（可选步骤，推荐初次操作质粒抽提的用户使用 ） Simge。