人参果胶对细胞迁移的影响及其机理研究.pdf

≮一’，!独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师指导下独立进行研究工作所取得的成果据我所知，除了特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果对本人的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名：日期：塑／里：多：塑学位论文使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编本学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：邋日期：迎＆：虚：汐学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：：—— 邮编：——摘要人参( P a n a x g i n s e n g C ．A ．M e y e r ) 是著名的中药，吉林省是中国人参的主要产区人参的有效成分包括多糖、皂苷、蛋白及其他一些小分子类物质研究表明人参多糖具有多种药理活性，但由于分离纯化较困难，人参多糖结构与活性的关系以及多糖作用的机制研究较少。

本论文以人参多糖中不同结构的果胶为研究对象，研究它们对细胞迁移的影响，以揭示多糖构效关系及作用机理人参多糖主要包括中性的淀粉样葡聚糖和酸性的果胶类多糖( G P ) 实验结果表明，人参果胶能特异性抑制L ．9 2 9 细胞的迁移，与对照组细胞相比，人参果胶对细胞迁移速度的最大抑制可达到6 0 ％它的抑制作用不受血清的影响，说明人参果胶是血清依赖和血清非依赖两种迁移途径的抑制剂为了研究人参多糖的构效关系，我们按照本实验室建立的方法将人参果胶进行了系统分级，得到9 种多糖级分，其．中包括4 种富含聚半乳糖醛酸( H G ) 结构域的级分( W G P A ．1 ．H G ，W G P A ．2 ．H G ，W G P A ．3 ．H G ，W G P A 4 ．H G ) ；2 种既含有H G 结构域又含有I 型聚鼠李半乳糖醛酸( R G ．I ) 结构域的级分( W G P A 一3 ．R G ，W G P A - 4 ．R G ) ：1 种富含葡聚糖的级分( W G P A ．N ) ；2 种富含阿拉伯半乳聚糖( A G ) 的级分( W G P A ．1 ．R G ，W G P A ．2 ．R G ) 。

我们研究了每一种级分对细胞迁移速度的影响结果显示，富含H G 结构域的果胶级分对细胞迁移速度具有明显的抑制作用，其作用强度的顺序为W G P A ．1 ．H G = ， 盥 已00 咧0 ．1 2 5m 9 ，一0 ，2 5 m 9 ，打-0 ．5 m g f 州BG l eM a nA mG a lS a l U AR h a1，OOOf．协．￡．J)p89d∞uo∞eJ6}￡a^薹2东北师范大学博士学位论文C乜1 ∞m 劈1C 皇一0巴嘎 ．挈写0芒- 皇0∞ 芝0O 061 22 4p r e t r e a t m e n tt i m e ( h )Dm i g r a t i o nt i m e ( h )F i g u r e2 ．2G Pi m p a i r e dL ．9 2 9c e l lm i g r a t i o n ．C e l l sp r e t r e a t e dw i t ho rw i t h o u t ( a sc o n t r 0 1 )v a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fc a r b o h y d r a t e s ( p o l y s a c c h a r i d e so rm o n o s a c c h a r i d e s ) w e r es c r a t c h e da n di n c u b a t e da sd e s c r i b e di nas t a n d a r ds c r a t c h i n ga s s a y ．( A ) G Pb u tn o to t h e rp o l y s a c c h a r i d e si m p a i r e dL ．9 2 9c e l lm i g r a t i o ni nd o s e ．d e p e n d e n tm a n n e r ．侣) T h ee f f e c t so fg l u c o s e ( G l c ) ，m a n n o s e ( M a n ) ，a r a b i n o s e ( A r a ) ，g a l a c t o s e ( G a l ) ，g a l a c t u r o n i ca c i d ( G a l U A ) a n dr h a m n o s e ( R h a ) o nL ．9 2 9c e l lm i g r a t i o n ．( C ) O p t i m i z et h ep r e t r e a t m e n tt i m ef o rs c r a t c h i n ga s s a y ．( D ) O p t i m i z et h em i g r a t i o nt i m ef o rs c r a t c h i n ga s s a y ．为了更好地体现人参果胶对细胞迁移的抑制作用，我们优化了划痕实验的条件，研究人参果胶预处理细胞的时间和迁移的时间。

我们将人参果胶预处理L ．9 2 9 细胞不同时间后，划痕，再迁移3h 结果如图2 —2 C 所示，当0 ．5m g ／m L 人参果胶预处理细胞0 、6 、1 2 、2 4h 时，细胞的相对迁移速度分别为O ．8 3 、O ．8 3 、0 ：6 3 、‘0 ．4 7 同样地，当0 ．2 5m g ／m L人参果胶预处理细胞0 、6 、1 2 、2 4h 时，细胞的相对迁移速度分别为0 ．9 2 、O ．8 9 、0 ．7 8 、0 ．6 1 这些结果说明人参果胶对细胞迁移的抑制作用依赖于预处理阶段，而且这种抑制作用随着预处理时间的增加而增强，当预处理时间为2 4h 时，人参果胶对细胞迁移的抑制作用达到最强因此在划痕实验中，选择人参果胶预处理细胞2 4h 作为最佳实验条件相对应地，我们将人参果胶预处理L ．9 2 9 细胞2 4h 后，划痕，再迁移不同时间如图2 - 2 D 所示，当0 ．5m g ／m L 人参果胶预处理细胞2 4h 后，迁移时间分别为2 、3 、4 、6 、9h ，细胞相对迁移速度分别为O ．7 9 、O ．4 6 、0 ．5 2 、0 ．6 9 和O ．8 3 实验结果显示，迁移时间为3h时，人参果胶对细胞迁移速度的抑制作用最明显。

因此在划痕实验中，选择细胞划痕后，细胞继续迁移3h 为最佳实验条件2 ．4 ．3 人参果胶对细胞迁移的影响采用划痕和趋化小室两种模型进行实验，检测人参果胶对细胞迁移的影响划痕实3 0，0O000一∞．E．J)刁∞∞△∞coIlm匕西一Em》^罩eIm拦东北师范大学博士学位论文验方法中，对照细胞和多糖处理细胞的划痕变化如图2 ．3 A 所示，定量分析结果显示G P能够明显抑制小鼠胚胎成纤维L ．9 2 9 细胞的迁移( 图2 ．3 B ) 抑制作用具有一定的浓度依赖性，当G P 浓度为O ．5m g ／m L 时，抑制程度达到最大值，约为5 4 ％同时，我们又用相同浓度的甘露聚糖( m a n n a n ) 和半乳聚糖( g a l a c t a n ) 作用细胞，结果显示甘露聚糖对细胞迁移并无抑制影响，反而高浓度的甘露聚糖对细胞迁移略有促进作用半乳聚糖对细胞迁移有微弱的抑制作用，当浓度为0 ．5m g ／m L 时，已达到最大抑制作用，约为2 3 ％O ．5m g ／m LG P 处理的细胞和0 ．5m g ／m L 半乳聚糖处理的细胞，它们的相对迁移速度分别为0 ．4 6 和0 ．7 8 。

这说明人参果胶和半乳聚糖对L ．9 2 9 细胞迁移都具有抑制作用，而人参果胶对L ．9 2 9 细胞迁移的抑制作用明显强于半乳聚糖的作用4 ．c o n t r o lm a n n a n0h3h黟溪黪谬黟鼍麓秀，7， G a l a c t a n 黪零罗翟，≤；《露鑫磊蠹窝酝巍≤逸滔G P东北师范大学博士学位论文 B， ∞E● 导 OO0 1 2 50 ．2 50 51 ．02 ．04 ．0c o n c e n t r a t i o n ( m g ／m 1 )F i g u r e2 - 3P o l y s a c c h a r i d e si m p a i r e dc e l lm i g r a t i o nb ys c r a t c h i n ga s s a y s ．( A ) R e p r e s e n t a t i v ei m a g e so fL - 9 2 9c e l l si nas c r a t c h i n ga s s a y ．L - 9 2 9c e l l sg r o w no na12 - w e l lt i s s u ec u l t u r ep l a t ew e r ei n c u b a t e df o r2 4hi nm e d i u mt h a tl a c k e d ( c o n t r 0 1 ) o rc o n t a i n e d0 ．5m g ／m Lo fc a r b o h y d r a t e s ．T h e n ，c e l l sw e r es c r a t c h e da n da l l o w e dt om i g r a t ef o r3h ：t h ec e l l sw e r ep h o t o g r a p h e da t0ha n d3h ．B a r ，3 0 0 “m ．( B ) Q u a n t i t a t i v ea n a l y s e so ft h ee f f e c t so fp o l y s a c c h a r i d e s ．D a t aw i t he r r o rb a r sa r et h em e a n so ft h r e ee x p e f i m e n t S ．撑0 ．0 01 茹弼一①-I口。

玳vQ协co茹姬．Ia—Eo > l l ∞一m 之(．∞．Lij．J)口母mcl∞co；∞．I功一I_cm>暑西一∞．I东北师范大学博士学位论文晰t ho rw i t h o u tc a r b o h y d r a t e sw e r es c r a t c h e d ．( A ) G P ，b u tn o tm a n n a r bi m p a i r e dH T 一10 8 0c e l lm i g r a t i o ni nad o s e - d e p e n d e n tm a n n e r ．( B ) N e i t h e rG Pn o rm a n n a na f f e c t e dH e L ac e l lm i g r a t i o n ．D a t a 诵t 1 1e r r o rb a r sa r et h em e a n so ft h r e ee x p e r i m e n t S ．群0 ．0 01 ll∞一①_l东北师范大学博士学位论文2 ．4 ．5 人参果胶存在于预处理和迁移两个阶段的重要性采用标准的划痕实验方法，细胞在预处理培养基中培养2。