（可编）基因的克隆、表达载体构建及功能验证.docx

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法）一、 基因克隆★ 事前三问a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？c.材料需要怎么处理？◎ 实验前准备工作a. 设计引物，准备材料，b. 购置试剂： Taq 酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒c. 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌； Amp + 、Kan+ 等抗生素准备※ 基本流程提取和纯化 RNA — cDNA 第一条链合成 — PCR—凝胶电泳 — 胶回收 — 连接 —转化 — 涂平板 — 挑单菌落 — 摇菌— 提质粒 — 测序1. 总 RNA的提取、纯化及 cDNA第一链合成1.1 叶片、根总 RNA的提取Trizol 是 一 种 高 效的 总 RNA 抽 提 试 剂，内 含 异 硫 氰 酸 胍 等 物 质 ，能 迅 速 裂 解植 物细 胞 ，抑 制 细 胞 释 放 出 的 核 酸 酶 ，所 提 取的 RNA 完 整 性 好 且 纯 度 高 ，以 利于下 一 步 的 实 验 1 ） 实 验 前 准 备预 先 配 制 0.1%的 DEPC水（ ddH2O中含 0.1%DEPC，V/V， 37 ℃过夜处理 12 h ），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理 ( 直接购买 ) 。

2) Trizol 法 （ 小 麦 ） 叶 片 或 根 的 总 RNA 实 验 步 骤 如 下 ：（ 1） 提前在 1.5 ml 离心管中加入 1 mlTrizol ，然后将 200 mg样品液氮中研磨成白色粉末， 移入管内，用力摇 15 s ，在 15- 30℃温育 5 min ，使 核 酸 蛋 白 复 合 物 完 全 分 离 2）4℃ ， 12000g 离 心 10min ，取 上 清 ，离 心 得 到 的 沉 淀 中 包 括 细 胞 外 膜 、多 糖 、高 分 子 量 DNA， 上 清 中 含 有 RNA 3） 吸 取 上 清 液 加 0.2 ml 氯仿，盖好盖，用力摇 15 s ， 15～ 30 ℃温育 2～ 3 min 4） 在≤ 12000g，4℃ 离心 10 min，样 品 分 为 三 层 ：底 层 为 黄 色 有 机 相 ，上 层 为 无色 水 相 和 一 个 中 间 层 ，RNA 主 要 在 水 相 中 ，水 相 体 积 约 为 所 用 TRIzol 试 剂 的 60%5） 将上层水相转移到新的 1.5 ml 离心管中，加 2 倍体积的无水乙醇沉淀 RNA，室温静止30 min 。

6） 在≤ 12000g，4℃离心 10 min ，离心前看不出 RNA 沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀7） 用≥ 1 ml 的 75%乙醇洗 RNA，涡旋振荡样品，在≤ 7500g，4℃离心 5 min ，弃上清8） 室温放置干燥或真空抽干 RNA沉淀， 大约晾 5-10 分钟，加无 RNase的水 100μl 用枪头吸几次， 55～ 60℃温育 10 min 使 RNA溶解9） 配制以下体系：10DNase buffer 5 μ lDNase I （RNase-free ）（40 μ g/ μ l ） 1 μ l RNasin Inhibitor （40 μg/ μ l ） 1 μ l Total RNA 70 μ g 加去 RNase水至总体积为 50 μ l（10）37 ℃水浴 1h，加 DEPC处理的水至总体积为 100 μ l ，加入等体积氯仿抽提一次11） 取上清， 加入 10 μl 的 3 mol/L NaAC溶液， 200 μ l 的无水乙醇， - 80 ℃沉淀 30 min 12） 2～8 ℃， 12000g 离心 10 min ，弃清液，干燥后取 50μ l 无 RNase的水溶解 RNA。

3） RNA 的质量及纯度检测（ 1）电泳检测 取 2ul RNA 与 1 ul 10 Loading buffer 上样缓冲液混合均匀在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察 RNA 条带并记录实验结果 2）分光光度计 RNA纯度检测取 1ul RNA液，以 DEPC水为空白对照，测定 A260/ A280 比值，估测 RNA质量4） cDNA 第一条链的合成按照以下体系将提取的总 RNA反转录成第一链 cDNA： 1） 在 Eppendorf 管中配制下列混合液：试剂名称 使用量模板 RNAOligo dT primer (501μM )μg1 μldNTP Mixture(10mM )1μlRNase free dH2O up to 10 μl 2） 65 ℃保温 15 min 后迅速在冰上急冷 2 min 3） 离心数秒使模板 RNA/引物等的混合液聚集 Eppendorf 管底部4） 在上述 Eppendorf 管中配制下列反转录反应液 :试剂名称 使用量上述模板 RNA/引物等的混合液 10 μl 5Frist -Stand Buffer 4 μl RNase Inhibitor(40 U/ μl ) 0.5 μl MTV RTase (10 U/ μl) 0.5 μlRNase free dH2O up to 20 μl5） 37 ℃保温 60 min 。

6） 95 ℃,5 min 后冰上冷却，得到的 cDNA溶液用于 PCR扩增1.2 小麦胚及胚乳总 RNA的提取（1） 配制 RNA抽提 buffer ，50 ml 中含有：1M Tris-HCl （ PH 9.0 ） 2.5 ml 4MNaCl 1.5 ml10%SDS 5 mlDEPC-H2O 41.25 ml（2） 取以上 RNA提取液 650 ul ，加 350 ul 水饱和酚，放入 1.5 ml 离心管中， 65 ℃水浴预热3） 研磨 0.3 g 材料，直至呈粉末状，待液氮刚刚挥发，迅速加入到上述预热的提取液中， 立即剧烈震荡，约 10 min 4） 再加入 400ul 氯仿，抽提 10 min ， 12000rpm 4 ℃离心 10 min 5） 取上清，加入等体积的氯仿，混匀摇 10 min ， 12000rpm 4 ℃离心 10 min 6） 取上清，加 1/3 体积的 8 M 氯化锂， 4 ℃保存过夜7） 离心 10 min，弃上清液，留沉淀，用 75%乙醇洗 1 次，再用无水乙醇洗 5-10 s，晾干， 溶于 80 ul DEPC 水中8） 加入 9 ul DNA酶 ( 无 RNA酶) ， 10 ul 10 buffer （ DNA酶所带）和 1 ulRasin （ Rnas抑制剂）， 37 ℃ 30 分钟（再加 500 ul 水）（9） 取出用 300 ul 氯仿和 300 ul 苯酚抽提，摇 10 min 钟，静止 10 min ， 12000 rpm 4 ℃ 离心 10 min 。

10） 取上清，加入等体积的氯仿，摇 10 min ，静止 10 min ， 4 ℃离心 10 min 11） 取上清，加 1/10 NaAC （ 3M，PH 5.2 ），再加 2 倍体积的预冷无水乙醇， -80 ℃冰箱过夜；（10） 12000rpm 离心 15 min，弃上清液，留沉淀，晾干，溶于 40 ul DEPC水中，电泳检测其完整性，保存于 -80 ℃，备用2.2.2.1 cDNA 第一条链的合成（1）基因组 DNA的去除反应试剂 使用量5xgDNA Eraser Buffer 2.0 ul gDNA Eraser 1.0 ulTotal RNA 5 ulRNase Free dH 2O up to 10.0 ul(2) 反转录反应42 ℃ 2 min 4 ℃ 10 min试剂 使用量@5xPrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0 ul@PrimeScript RT Enzyme MixI 1.0 ulRT Prime Mix 1.0 ul①的反应液 10.0 ulRNase Free dH 2O up to 20.0 ul37 ℃ 15 min85 ℃ 5 sec4 ℃ 10 min -20 ℃ 保存备用2. 基因 cDNA克隆2.1 基因片段的 PCR扩增以反转录后的 cDNA为模板进行 PCR扩增。

PCR反应体系为 20ul ：10PCRBuffer 2.0 ul ，2.5 mMdNTPs 1.6 ul ， 10 mM上下游引物各 0.8 ul ， Taq 酶 0.3 ul ，模板 cDNA1.0 ul ，ddH2O 补足至 20 ul 按照下列条件进行 PCR扩增：94℃4min94℃30sec50℃40sec30 cycles72℃1min72℃10 min2.2 PCR 扩增产物的检测和回收纯化PCR扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶 ( 含有 0.5 ug/ml 溴化乙锭 ) 上进行电泳，在紫外灯照射下进行观察， 与标准分子量进行比较估测扩增 DNA片段的大小， 若与预计的大小相符， 则使用琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒将扩增出的片段回收，主要操作步骤如下：1) 在紫外灯下切下将要回收的条带 ( 尽量使用长波长的 UV)，称重2) 按每 100 mg 琼脂糖胶加入 300 ul 溶胶液 PN，置于 50 ℃水浴中 10 min ，每隔 2 min混匀一次，使胶彻底融化，室温放置 2 min 3) 将 UNIQ-10 柱放入 2 ml 的收集管中，加入 600 ul 平衡液 BL，13000rpm，离心 30 sec 。

3) 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的平衡液，将融化的胶溶液转移到 UNIQ-10 柱中，静止2-3 min ， 13000rpm，离心 30 sec 4) 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，再放回收集管中，加入 700 ul 漂洗液 PW使( 用前先检查是否已加入无水乙醇 ) ， 13000rpm 离心 30 sec 5) 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，放回收集管中，加入 500 ul 漂洗液 PW，13000 rpm 离心 30 sec ，重复一次6) 取下 UNIQ-10 柱，倒掉废液，放回收集管中 ,13000rpm ，离心 2 min 7) 将 UNIQ-10 柱放入一新的 1.5 mlEp 管中， 在柱子的吸附膜中央悬空滴加 50 ul 预热 70℃ 洗脱液 EB，室温放置 5 min 8) 12000 rpm ，离心 l min ，Ep 管中液体即为回收的 DNA片段， - 20℃保存备用2.3 回收产物与 PMD-T载体的连接与转化采用 TAKARA公司的 PMD-T载体进行连接反应， 感受态细胞 DH5a作为转化细胞进行转化具体操作步骤如下：SolutionI 、PMD18-T或 19-T 、 DNA回收产物置于冰中溶解。

在 0.2ml 离心管中配制。