生物技术制药：4-抗体工程制药-3.ppt

第四节第四节 噬菌体抗体工程噬菌体抗体工程一、噬菌体展示技术基本原理一、噬菌体展示技术基本原理抗体库技术抗体库技术Ø抗体库抗体库————在原核系统功能性表达多样性抗体基在原核系统功能性表达多样性抗体基因因(repertoire)(repertoire)Ø通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因抗体库技术产生的三项技术基础抗体库技术产生的三项技术基础uRT-PCRRT-PCR：：能够克隆全套抗体可变区基因能够克隆全套抗体可变区基因u噬菌体展示技术（噬菌体展示技术（phage display)phage display) u抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达一、基本原理一、基本原理Ø模拟体内模拟体内B B细胞产生抗细胞产生抗体的过程体的过程Ø可绕过免疫直接制备可绕过免疫直接制备全人源性抗体全人源性抗体接头接头DNADNAVH VLVH VL噬菌体表面呈现的小分子抗体噬菌体表面呈现的小分子抗体 基因基因IIIIII或或基因基因VIII VIII 外壳蛋白外壳蛋白 VHVHVL抗体库的构建抗体库的构建抗体库的构建抗体库的构建抗体库的富集筛选抗体库的富集筛选二、噬菌体抗体库二、噬菌体抗体库（一）噬菌体抗体库种类（一）噬菌体抗体库种类Ø1.1.天然抗体库天然抗体库：来源于未经免疫的供体。

代表天：来源于未经免疫的供体代表天然抗体在供体内的抗体谱，亲和力低然抗体在供体内的抗体谱，亲和力低Ø2.2.免疫抗体库免疫抗体库：来源于经免疫的供体亲和力高，：来源于经免疫的供体亲和力高，多样性低多样性低Ø3.3.半合成抗体库半合成抗体库：：CDR1CDR1和和CDR2CDR2来自人胚系，来自人胚系，CDR3CDR3随机合成库容大，亲和力低随机合成库容大，亲和力低Ø4.4.合成抗体库合成抗体库：：VHVH和和VLVL基因合成基因合成VH PoolVL PoolscFv Pool105 DNA Sequences105 DNA SequencesRandomly LigateCombinatorial（二）噬菌体抗体库的表达载体（二）噬菌体抗体库的表达载体Ø1.lamda1.lamda噬菌体噬菌体Ø2.2.丝状噬菌体丝状噬菌体Ø3.3.噬菌粒噬菌粒一、一、 抗体库技术抗体库技术Ø1.1.获取目的基因：获取目的基因：RT-PCRRT-PCRØ2.2.抗体库技术的载体：噬菌粒（抗体库技术的载体：噬菌粒（phagemidphagemid）载体）载体Ø3.3.淘筛（淘筛（panningpanning）：用固相化抗原对表达产物）：用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。

大量扩增Ø4.4.表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Western Western blotblot分析确定后，就完成了全过程分析确定后，就完成了全过程三）噬菌体抗体库的构建方法（三）噬菌体抗体库的构建方法Phage Display of Fab To Optimize AntibodiesGene IIICH1VHCLVLVLVHGene IIIExpression Plasmid - “Phagemid”Escherichia coliPeptide DisplayNew England BiolabsPhD SystemE. coli109 different 7-mer peptidesCa. 100 copies each/assayØ设计设计V VH H/V/VL L或或L L链链/ /FdFd链基因上、下游引物进行链基因上、下游引物进行RT-RT-PCRPCRØ将将PCRPCR产物产物V VH H/V/VL L或或L L链链/ /FdFd链重组到粘粒或杆状噬菌链重组到粘粒或杆状噬菌体载体中建立文库体载体中建立文库Ø近年来近年来PCRPCR技术的发展简化了获取可变区基因的过技术的发展简化了获取可变区基因的过程，用程，用5′5′端前导顺序或端前导顺序或框架区引物框架区引物及及3′3′端恒定端恒定区域区域V V基因中的基因中的J J区引物，可以从很少量的细胞中区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到可变区片段，扩增得到可变区片段，PCRPCR产物能直接克隆到表达产物能直接克隆到表达载体上。

通常针对不同的载体上通常针对不同的VHVH和和VLVL家族采用不同的家族采用不同的引物109different phagef1 oriAmprRE1 (xxxn) RE2gene VIII(xxx)nPhage-displayed Peptide LibrarySelection From Library of Random MutantsRandom Library ofDNA SequencesGene 3 or 8+Gene 3 FusionsEach Phage DisplaysOne Peptide SequenceTranslated from DNA to Peptide in E. coli筛选筛选Ø（（1 1）表位筛选）表位筛选 纯抗原筛选纯抗原筛选 全细胞或裂解液进行筛选全细胞或裂解液进行筛选Ø（（2 2）功能性筛选：生物学功能，如抗体酶）功能性筛选：生物学功能，如抗体酶Ø（（3 3）选择性感染筛选：噬菌体感染能力的）选择性感染筛选：噬菌体感染能力的恢复恢复 Ø1.固相或液相纯抗原的筛选、固相或液相纯抗原的筛选、Ø2.全细胞筛选、全细胞筛选、Ø3.切片组织筛选切片组织筛选E. coliSequence Fusion DNAReplicateAmplify“Winners”InfectPurifyPanning Methodology 噬菌体表面展示文库技术的要点噬菌体表面展示文库技术的要点: : 外源基因表达多肽以外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示融合蛋白形式展示在外壳蛋白在外壳蛋白N N端端将基因组合文库将基因组合文库插入噬菌体插入噬菌体编码膜蛋白的基因编码膜蛋白的基因g3g3或或g8g8的先导系列的紧靠下游的先导系列的紧靠下游随机随机克隆克隆入相应载体形成入相应载体形成组合文库组合文库从免疫或未被免疫的从免疫或未被免疫的B B细胞中细胞中PCRPCR扩增扩增抗体全套基因片段抗体全套基因片段用固相化抗原经用固相化抗原经““亲和结合一洗脱一扩增亲和结合一洗脱一扩增””数个循环数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

和力强的抗体噬菌体库使翻译出的抗体使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内分泌到细菌的质周腔内，形成游离的，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体筛选到的噬菌体再将筛选到的噬菌体再将基因基因g3g3或或g8g8切除后，切除后，转入大肠杆转入大肠杆菌菌，，三、噬菌体抗体库技术的特点及应用三、噬菌体抗体库技术的特点及应用Ø1 1、建立具有相当容量的抗体库：、建立具有相当容量的抗体库：组合库Ø2 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术、避开了人工免疫和杂交瘤技术：抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术Ø3 3、适合工业化生产：、适合工业化生产：用细菌操作Ø4 4、模拟天然全套抗体库、模拟天然全套抗体库：1011库容，包含B细胞全部克隆来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录的cDNA扩增，是人体多克隆细胞的总mRNA使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性Ø5 5、抗体表型与基因型一致、抗体表型与基因型一致Ø6 6、筛选后得到的人源化可变区抗体，无异种蛋白反应、筛选后得到的人源化可变区抗体，无异种蛋白反应Ø可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。

宿主细胞: 杂交瘤 细菌筛选范围 : ~103 107109时间: 几个月 几周操作: 繁杂 相对简单免疫: 必须 可避免人源抗体:  +费用: 高 低生产量: 有限 无限基因获取: 再克隆 直接应用前景: 有限 不可估 抗体库介绍抗体库介绍Ø英国剑桥抗体技术公司英国剑桥抗体技术公司（（Cambridge Antibody Technology, Cambridge Antibody Technology, CATCAT），现被英国），现被英国MedImmuneMedImmune公司收购。

公司收购CATCAT是噬菌体展示技术是噬菌体展示技术领域的领先者，其抗体基因来源于领域的领先者，其抗体基因来源于健康人的血液细胞健康人的血液细胞，已经，已经建立了库容为建立了库容为10101111噬菌体文库通过结合全自动装置和基因噬菌体文库通过结合全自动装置和基因组技术，进行高通量分离和筛选组技术，进行高通量分离和筛选CATCAT还建立了自动化的培养还建立了自动化的培养基通量克隆、转染和纯化系统，用于将基通量克隆、转染和纯化系统，用于将ScFvScFv转变成完整的转变成完整的IgGIgGCATCAT上市产品有抗上市产品有抗TNF-αTNF-α的阿达木单抗的阿达木单抗（（AdalimumabAdalimumab，，HUMIRAHUMIRA）；处于）；处于ⅢⅢ期临床试验的抗期临床试验的抗IL-12IL-12和和IL-23IL-23的的BriakinumabBriakinumab（（ABT-874.ABT-874.）；）；Ø美国美国DyaxDyax公司公司建立了的建立了的半合成半合成FabFab噬菌体抗体库噬菌体抗体库，库容为，库容为3.5×103.5×101010该抗体库的重链该抗体库的重链CDR1CDR1和和CDR2CDR2序列为合成引物克隆序列为合成引物克隆的，重链的，重链CDR3CDR3序列和轻链基因来源于人的序列和轻链基因来源于人的B B细胞。

该抗体库细胞该抗体库目前处于临床试验目前处于临床试验ⅢⅢ期的产品有抗期的产品有抗VEGFR2VEGFR2的的Ramucirumab Ramucirumab (IMC-1121B)(IMC-1121B)和抗和抗EGFREGFR的的MC-11F8*MC-11F8*；；Ø德国德国MorphoSysMorphoSys AG AG公司公司建立了一个建立了一个人组合抗体库人组合抗体库( (Human Human Combinatorial Antibody LibraryCombinatorial Antibody Library，，HuCALHuCAL) )HuCALHuCAL的基因的基因都是通过合成得到的，该公司已经建立了库容为都是通过合成得到的，该公司已经建立了库容为1.6×101.6×101010的的FabFab噬菌体抗体展示文库噬菌体抗体展示文库目前处于临床试验的药物有：抗目前处于临床试验的药物有：抗Aβ40/42Aβ40/42的的GantenerumabGantenerumab等等噬菌体展示技术的应用现状噬菌体展示技术的应用现状 1.1.抗体：抗体：2.2. 抗狂犬病毒的单链抗体，抗抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1HIV-1囊膜糖囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1HIV-1感染并表达有感染并表达有gp120gp120的淋巴细胞的淋巴细胞, , 中和响尾蛇毒中和响尾蛇毒素的单链抗素的单链抗体体，等等。

等等3.3.2.2.疫苗：疫苗： 展示在噬菌体表面的展示在噬菌体表面的HIV-1 HIV-1 的的gp120-V3 gp120-V3 环环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答可象天然抗原一样引起显著的免疫应答, , 等等等等3. 3. 多肽类药物：多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一出来；已获得一13 13 肽，它能中和蛇毒肽，它能中和蛇毒 α-α-bungarotoxinbungarotoxin；从；从CX7C CX7C 多肽库中掏选到一个多肽多肽库中掏选到一个多肽能与能与 Hantavirus Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或结合，并使该病毒不能结合或感染细胞人血管促生素（感染细胞人血管促生素（angiogeninangiogenin）是一种）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8 8肽能肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性等等。

等等4.4.肿瘤药物导航载体：肿瘤药物导航载体： 用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具向输送工具 一个成功的实例是：将噬菌体多一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲来展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力将此多肽与细胞毒素和力将此多肽与细胞毒素 doxorubicin doxorubicin 偶联结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果. .Ø已上市的有阿达木单抗已上市的有阿达木单抗HumiraHumira ( (adalimumabadalimumab, , D2E7)D2E7)，第一个全人单抗（，第一个全人单抗（20022002））Ø从事全人源抗体开发的英国剑桥抗体技术公司从事全人源抗体开发的英国剑桥抗体技术公司(CAT)(CAT)和和Abbott LaboratoriesAbbott Laboratories公司采用的噬菌体公司采用的噬菌体展示技术，筛选的抗展示技术，筛选的抗TNF-TNF- （（D2E7D2E7）全人抗体。

全人抗体HumiraHumira用于治疗类风湿性关节炎用于治疗类风湿性关节炎 Ø目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处Ø如从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不如从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样性等足以涵盖一些动物的抗体多样性等Ø因此，大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对因此，大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键稀有抗原抗体的关键第五节　转基因动物表达抗体第五节　转基因动物表达抗体（一）分泌完全人源化抗体转基因鼠的建立（一）分泌完全人源化抗体转基因鼠的建立Ø噬菌体抗体库技术得到的是小分子人源化抗体，噬菌体抗体库技术得到的是小分子人源化抗体，不能得到完整抗体不能得到完整抗体Ø1994年美国年美国Cell Genesys公司和公司和Genpharm国国际公司同时得到转人抗体基因小鼠际公司同时得到转人抗体基因小鼠 (human antibody mouse，，HuMab)Ø将小鼠将小鼠IgIg基因敲除，转染人基因敲除，转染人IgIg基因，在小鼠体内基因，在小鼠体内产生人产生人AbAb，，再经杂交瘤技术，产生大量再经杂交瘤技术，产生大量完全人源完全人源化抗体化抗体（（19971997年）年）ØXenomouseXenomouse（（AbgenixAbgenix）含）含1020 kb1020 kb人人IgIg重链和重链和800 800 kbkb的人的人IgκIgκ轻链基因的基因敲除小鼠。

轻链基因的基因敲除小鼠ØXenomouseXenomouse含大多数人重链含大多数人重链(66/95 VH)(66/95 VH)和和K K轻链轻链(32/76 VL)(32/76 VL)可变基因、全部可变基因、全部D D区和区和JHJH区、人重链和区、人重链和K(CK)K(CK)恒定区及已知与恒定区及已知与IgIg有关的多数调控元件有关的多数调控元件ØXenomouseXenomouse建立了较强的体建立了较强的体液免疫功能能诱导类似液免疫功能能诱导类似于人类的多样性初次免疫于人类的多样性初次免疫应答用人抗原再次免疫应答用人抗原再次免疫XenomouseXenomouse可发生强烈的二可发生强烈的二次免疫应答，产生高亲和次免疫应答，产生高亲和性的人性的人IgIg单抗单抗XenoMouse® Technology:Over 6 Years of Proven SuccessMouse Ab Genes InactivatedXenoMouse MiceHuman Ab Genes IntroducedØ凯龙公司（凯龙公司（ChironChiron），），GenentechGenentech、辉瑞公司、辉瑞公司（（PfizerPfizer）安进公司）安进公司AmgenAmgen得到得到AbgenixAbgenix 公司的公司的XenoMouseXenoMouse授权的专利技术授权的专利技术Ø目前，用目前，用XenoMouseXenoMouse小鼠产生的人单抗有抗小鼠产生的人单抗有抗EGFREGFR、、IL-8IL-8、、TNF-aTNF-a、、IL-6IL-6、、L-L-selectinselectin和和CD147CD147等等ØAbgenixAbgenix公司采用公司采用XenoMouseXenoMouse得到的针对得到的针对EGFREGFR的人的人抗体抗体( (panitumumab，ABX-EGF)ABX-EGF) 已经上市已经上市 Ø帕尼单抗帕尼单抗( (PanitumumabPanitumumab) :) :靶向表靶向表皮生长因子受体皮生长因子受体(EGFR)(EGFR)的全人源化的全人源化单克隆抗体单克隆抗体, ,治疗结肠直肠癌治疗结肠直肠癌 Ø2006/09 2006/09 Ø包装规格包装规格: 400: 400毫克毫克/20/20毫升毫升/ /瓶瓶 销售单价销售单价(US): 4,724(US): 4,724美元美元 销售单价销售单价(RMB): 32,120 (RMB): 32,120 元元 PANITUMUMABMouse antibody genes inactivatedHuman antibody genes introducedXenoMouseâ â mouseXenoMouseXenoMouse generates generates fully humanfully human antibodies antibodiesPanitumumabPanitumumab is a fully human IgG2 directed is a fully human IgG2 directed against against EGFrEGFrHigh AffinityHigh AffinityØ1.1.微基因重组子技术微基因重组子技术: :把人把人IgIg基因组中间断存在的基因组中间断存在的基因片段连接在一起，分别组建成轻重链微基因，基因片段连接在一起，分别组建成轻重链微基因，将微基因质粒注入小鼠胚胎原核中，获得转基因将微基因质粒注入小鼠胚胎原核中，获得转基因鼠。

与内源性重链，轻链缺失的鼠杂交，获得双鼠与内源性重链，轻链缺失的鼠杂交，获得双转移基因，双链缺失的纯和鼠，免疫该鼠后，取转移基因，双链缺失的纯和鼠，免疫该鼠后，取脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交，获分泌人抗体的杂脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交，获分泌人抗体的杂交瘤细胞交瘤细胞Ø2.2.微胞干细胞杂交技术：微胞干细胞杂交技术： 技术有待于改进技术有待于改进Ø3.3.酵母人工染色体酵母人工染色体：未重排的：未重排的IgIg基因构建成酵母人基因构建成酵母人工染色体，转入小鼠，获分泌人抗体的转基因鼠工染色体，转入小鼠，获分泌人抗体的转基因鼠l微注射法微注射法l细胞融合法细胞融合法 此技术优于微基因法，但技术困难此技术优于微基因法，但技术困难（二）小鼠生产完全人源抗体的机制（二）小鼠生产完全人源抗体的机制抗体成熟经过两种特征结构改变抗体成熟经过两种特征结构改变Ø（（1 1）抗原刺激下，）抗原刺激下，体细胞超变体细胞超变：即可变区与抗原：即可变区与抗原结合部位基因随即突变，再次产生抗体多样性结合部位基因随即突变，再次产生抗体多样性Ø（（2 2））抗体类别转换抗体类别转换：持续刺激，：持续刺激，B B细胞产生细胞产生IgMIgM转转为为IgGIgGØ人基因与鼠的基因重组与表达机制相容，但常规人基因与鼠的基因重组与表达机制相容，但常规鼠优先表达内源鼠鼠优先表达内源鼠IgIg，故需利用基因打靶技术鼠，故需利用基因打靶技术鼠抗体表达。

抗体表达Ø转基因鼠技术利用鼠天然产生抗体多样性及选择转基因鼠技术利用鼠天然产生抗体多样性及选择机制，使其作用于人机制，使其作用于人IgIg，发生基因重排和超变发生基因重排和超变Ø运用常规免疫策略免疫该鼠产生高亲和力的完全运用常规免疫策略免疫该鼠产生高亲和力的完全人源化抗体人源化抗体获取人获取人IgIg基因：构建人基因：构建人IgIg的的YACYAC文库及筛选文库及筛选小鼠胚胎干细胞培养小鼠胚胎干细胞培养小鼠内源性小鼠内源性IgIg基因的敲除基因的敲除获得完整人获得完整人Ig-YACsIg-YACs克隆克隆Ig-YACsIg-YACs克隆小克隆小ESES细胞的导入细胞的导入纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体纯合小鼠的产生和鉴定纯合小鼠的产生和鉴定含人含人Ig-YACsIg-YACs的的ESES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合含人含人Ig-YACsIg-YACs的的ESES细胞移入小鼠胚胎细胞移入小鼠胚胎Ø转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列, ,导致不十分完全的人序列导致不十分完全的人序列Ø产生单抗具有产生单抗具有““鼠糖基化模式鼠糖基化模式””Ø操作程序复杂操作程序复杂其他转基因鼠其他转基因鼠lHuMAbHuMAb-Mouse-Mouse是美国是美国MedarexMedarex公司制备的含人公司制备的含人IgIg基因的转基因小基因的转基因小鼠。

这种转人抗体基因小鼠（鼠这种转人抗体基因小鼠（Human antibody mouse, Human antibody mouse, HuMabHuMab）构建方法与）构建方法与XenoMouseXenoMouse相似，是将小鼠的抗体基因换成相似，是将小鼠的抗体基因换成人的抗体基因人的抗体基因HuMAbHuMAb-Mouse-Mouse含有编码人重链和轻链的关键基含有编码人重链和轻链的关键基因序列，而自身抗体基因失活其所携带的人抗体基因片段具因序列，而自身抗体基因失活其所携带的人抗体基因片段具有完备的功能，可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟，任有完备的功能，可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟，任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的全人单何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的全人单抗HuMAbHuMAb-Mouse-Mouse携带的人抗体基因非常稳定，可以传递给子携带的人抗体基因非常稳定，可以传递给子代小鼠Ø利用利用HuMAbHuMAb-Mouse-Mouse研制的全人单抗有研制的全人单抗有20092009年上市的年上市的抗抗TNFαTNFα的的GolimumabGolimumab ( (SimponiSimponi戈利木单抗戈利木单抗 ) )。

另另外，抗外，抗CD4CD4单抗已进入临床试验阶段单抗已进入临床试验阶段lTC MouseTC Mouse是日本是日本Kirin BreweryKirin Brewery（（KHKKHK）公司制备转染色体）公司制备转染色体鼠这种小鼠的抗体基因已经被含有全部人抗体基因的人鼠这种小鼠的抗体基因已经被含有全部人抗体基因的人染色体替代，所以这种小鼠可以产生各种各样类型的全人染色体替代，所以这种小鼠可以产生各种各样类型的全人抗体lKM-MouseKM-Mouse是是KHKKHK公司的公司的TC MouseTC Mouse与与MedarexMedarex公司的公司的HuMAbHuMAb- -MouseMouse杂交后产生一种新的小鼠杂交后产生一种新的小鼠KM MouseKM Mouse具有从具有从TC TC MouseMouse来源的人来源的人1414号染色体片段（人号染色体片段（人IgIg重链）和来源于重链）和来源于HuMAbHuMAb Mouse Mouse的的IgκIgκKM MouseKM Mouse能产生高亲和性的人源化能产生高亲和性的人源化抗体的大多数亚类，包括抗体的大多数亚类，包括IgG1IgG1、、IgG2IgG2、、IgG3IgG3、、IgG4IgG4和和IgAIgA。

已上市的人源化抗体已上市的人源化抗体Ø靶向表皮生长因子受体靶向表皮生长因子受体(EGFR)(EGFR)的全人单抗的全人单抗（（panitumumabpanitumumab ABX-EGF), ABX-EGF),用于治疗多种过度表达用于治疗多种过度表达EGFREGFR的肿瘤的治疗，如：结肠癌的肿瘤的治疗，如：结肠癌,05,05年年7 7月获月获FDAFDA批批准准ØABXIL-8:ABXIL-8:靶向白细胞介素靶向白细胞介素8(IL-8)8(IL-8)的全人单抗的全人单抗, ,用用于治疗自身免疫疾病于治疗自身免疫疾病( (包括牛皮癣和类风湿关节炎）包括牛皮癣和类风湿关节炎）( (AbgenixAbgenix Inc Inc））抗体工程在制药工业应用抗体工程在制药工业应用一、一、 抗体治疗药物抗体治疗药物Ø以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有2020多年多年的历史的历史, ,研究进展迅速研究进展迅速. .抗体的治疗机制抗体的治疗机制（（1 1）中和作用）中和作用( (NeutrilizationNeutrilization) ) 用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。

素丧失致病力 （（2 2））示示踪踪或或导导向向作作用用Tracer Tracer or or targeted targeted effecteffect 使使与与其其相相连连的的功功能能性性分分子子特特异异性性地地激激活活或或封闭、破坏靶细胞或靶分子封闭、破坏靶细胞或靶分子Ø（（3 3）竞争性抑制作用）竞争性抑制作用/ /拮抗作用拮抗作用（（Competitive inhibitionCompetitive inhibition）） 与体内产生或体外进入的物质结合，阻与体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害止其与靶分子作用产生毒性损害Ø（（4 4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ ADCCADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（）及补体依赖性细胞溶解作用（CDCCDC）Ø（（5 5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性安全性及广泛性 问问 题题Ø异源蛋白导致产生抗抗异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果体，影响靶向性和效果Ø靶部位摄取的量太低靶部位摄取的量太低Ø效应功能弱效应功能弱Ø在体内被清除速度快在体内被清除速度快 对对 策策Ø抗体人源化抗体人源化Ø改变抗体大小改变抗体大小Ø连接毒素、放射性同位连接毒素、放射性同位素、药物素、药物Ø抗体人源化抗体人源化（１）抗体治疗存在的问题及对策（１）抗体治疗存在的问题及对策•抗体人源化和人源抗体制备抗体人源化和人源抗体制备•改变抗体分子大小改变抗体分子大小•增强抗体亲和力增强抗体亲和力•增强抗体效应功能增强抗体效应功能抗体药物改造的方向抗体药物改造的方向（２）分子构成（２）分子构成-抗体药物可分抗体药物可分4 4类：类：Ø(1)(1)抗体抗体( (裸抗体裸抗体),),根据人源化的程度，分为嵌合抗体、根据人源化的程度，分为嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体。

人源化抗体、完全人抗体Ø(2)(2)抗体片段，包括抗体片段，包括FabFab ，，scFvscFv，，diabodydiabody等Ø(3)(3)抗体偶联物抗体偶联物( (免疫偶联物免疫偶联物),),由抗体或抗体片段与由抗体或抗体片段与““弹头弹头””药物连接而成药物连接而成 “ “弹头弹头” ” 物质有放射性核素、化疗药物与毒素这物质有放射性核素、化疗药物与毒素这些些““弹头弹头””物质与抗体连接，分别构成物质与抗体连接，分别构成放射免疫偶联放射免疫偶联物物、、化学免疫偶联物化学免疫偶联物与与免疫毒素免疫毒素Ø(4)(4)抗体融合蛋白，由抗体片段和活性蛋白两个部分抗体融合蛋白，由抗体片段和活性蛋白两个部分构成（３）可用抗体治疗的疾病（３）可用抗体治疗的疾病移移植植排排斥斥肿肿瘤瘤自自身身免免疫疫病病心心血血管管疾疾病病感感染染性性疾疾病病过过敏敏性性疾疾病病银屑病：银屑病：IL-8IL-8，，CD11aCD11a，，ICAM-3ICAM-3，，CD80CD80，，CD2CD2，，CD3CD3RARA：：ComplementComplement（（C5C5），），TNF-αTNF-α，，CD4CD4CrohnCrohn，，s s 病：病：TNF-αTNF-α溃疡性结肠炎：溃疡性结肠炎：α4β7α4β7SLE(SLE(红斑狼疮红斑狼疮) ：：C5C5，，CD40LCD40L多发性硬化症：多发性硬化症：VLA-4VLA-4（（整联蛋白）整联蛋白） ，，CD40LCD40L（４）治疗性抗体的靶分子（４）治疗性抗体的靶分子自身免疫性血液系统疾病：自身免疫性血液系统疾病：CD64CD64哮喘哮喘：：ILIL－－5 5，，ILIL－－4 4，，IgEIgE，，CD23CD23GVHDGVHD：：CD147CD147，，CD2CD2，，同种移植物排斥：同种移植物排斥：CD3CD3，，CD25CD25，，β2 β2 integrinintegrin，， 　　　　　　　　　　　　　　　　　　CD4CD4，，CD147CD147，，CD40LCD40L，，CD18CD18中风：中风：β2 β2 integrinintegrin青光眼手术：青光眼手术：TGF-β2TGF-β2肿瘤肿瘤 卵巢癌卵巢癌：：CA125CA125 结肠癌结肠癌：：1717－－1A1A 肺癌肺癌：：GD3GD3表位表位 头颈部癌头颈部癌：：EGFREGFR 乳腺癌乳腺癌：：HER2/neuHER2/neu 肉瘤肉瘤：：αVβ3 αVβ3 integrinintegrin CLLCLL：：CD52CD52 AMLAML：：CD33CD33 NHLNHL：：CD20CD20，，CD22CD22，，HLAHLA，，HLA DRHLA DR （５（５.１）１）抗体药物的主要作用领域－肿瘤抗体药物的主要作用领域－肿瘤Ø肿瘤治疗肿瘤治疗一直是抗体药物研发最活跃的领域。

一直是抗体药物研发最活跃的领域Ø19971997年美国批准第一个抗肿瘤抗体药物年美国批准第一个抗肿瘤抗体药物RituximabRituximab治疗治疗NHLNHLØ目前上市的抗体药物有目前上市的抗体药物有1010个以上用于肿瘤治疗，个以上用于肿瘤治疗，在临床在临床2 2期或期或3 3期的中期的中40%40%是抗肿瘤的，达数十种是抗肿瘤的，达数十种Ø疗效最确切：疗效最确切：AvastinAvastin（（20042004年，人源化，抗年，人源化，抗VEGFVEGF）和）和 ErbituxErbitux（（爱必妥爱必妥, 20042004年，嵌合，抗年，嵌合，抗上皮生长因子）上皮生长因子）分类分类Ø1.1.细胞表面受体细胞表面受体( (或抗原或抗原) )之抗体制剂：之抗体制剂：(1)(1)抗抗-CD20 (-CD20 (RituxanRituxan):): (2)(2)抗表皮生长因子受体抗表皮生长因子受体EGFR(CetuximabEGFR(Cetuximab，施贵宝，施贵宝):):正常和肿瘤细胞的表皮生长因子受体正常和肿瘤细胞的表皮生长因子受体（（EGRF,HER1,c-ErbB-1EGRF,HER1,c-ErbB-1）相结合）相结合, ,竞争性抑制表皮生竞争性抑制表皮生长因子受体与其他配体如转化生长因子长因子受体与其他配体如转化生长因子αα的结合。

的结合 抗抗-HER2/neu (-HER2/neu (HerceptinHerceptin, , 贺癌平贺癌平) )等抗体 (3) (3)抗免疫逃逸分子抗免疫逃逸分子CD47(“CD47(“万能抗体万能抗体””））Ø抗体药物通过多种机制发挥抗肿瘤作用：抗体药物通过多种机制发挥抗肿瘤作用：Ø抗体依赖细胞毒作用抗体依赖细胞毒作用ADCCADCC和补体依赖细胞毒作用和补体依赖细胞毒作用CDCCCDCC等直接杀伤瘤细胞，等直接杀伤瘤细胞，Ø改变细胞信号转导，诱导瘤细胞凋亡改变细胞信号转导，诱导瘤细胞凋亡Ø抗体还可以靶向运送细胞毒结合物直接杀伤瘤细抗体还可以靶向运送细胞毒结合物直接杀伤瘤细胞RituxanRituxan Mechanism MechanismØADCCADCCØCDCCCDCCØApoptosis-bindingApoptosis-binding causes cell suicide causes cell suicideB-CellsCD20CD20ReceptorReceptorCD20 Receptor not present CD20 Receptor not present on B-Cell Progenitorson B-Cell Progenitors19971997年美国上市的利妥昔单抗（年美国上市的利妥昔单抗（rituximabrituximab）为重组嵌合）为重组嵌合抗抗CD20CD20单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。

临床应用阶段EGFRHER4HER3HER2HER2HER2HRGNRG-2NRG-3BTCEPRHB-EGFEGF TGF AR人表皮生长因子家族成员及其配体人表皮生长因子家族成员及其配体Tyrosine - kinasedomainEGFR (ErbB) family and ligandsCysteine - richdomainserbB-1HER1EGFRerbB-2HER2neuerbB-3HER3erbB-4HER4C-Terminus100100100448233365924487928TRASTUZUMABTRASTUZUMAB CETUXIMAB CETUXIMAB西妥昔西妥昔西妥昔西妥昔 PANITUMUMABPANITUMUMABTyrosine kinase inhibitorsTyrosine kinase inhibitors( (gefitinibgefitinib, erlotinib), erlotinib)MonoclonalMonoclonalAntibodiesAntibodies(trastuzumab,cetuximab, (trastuzumab,cetuximab, panitutumab)panitutumab)Signal TransductionRRKKLigandsEGFR- targeting therapies易瑞沙(吉非替尼，Iressa) EGFR Activation Enhances Pathways Important for Tumor Cell GrowthAngiogenesisCellSurvivalMetastaticSpreadEGFR ActivationTumorBloodVesselBloodVesselProliferationPanitumumab Inhibits Ligand Binding to EGFR and DimerizationPanitumumabInhibition of EGF binding to EGFRThis may lead to: Cell proliferation Cell survival Angiogenesis Metastatic spreadEGF, TGFα or other ligands binding to EGFRlA fully human* lgG2 monoclonal antibody to EGFRlHigh affinity, KD = 5 x 10-11 MlInhibits ligand-induced EGFR tyrosine phosphorylationHerceptin (抗体名称) 人源化抗体HER-2乳腺癌 cellHerceptin + 化疗治疗乳腺癌的疗效化疗治疗乳腺癌的疗效 单独化疗单独化疗 Herceptin + 化疗化疗 有效率有效率 32% 50% 中位有效期中位有效期 6.1月月 9.1月月 1年死亡率年死亡率 33% 22% 中位生存时间中位生存时间 20.3月月 25.1月月抗CD47抗体可以通过阻断CD47向巨噬细胞传递‘不吃我’信号而显著抑制实体瘤生长人类癌细胞都表达CD47，相比于正常细胞通常以较高水平表达Anti-CD47: A Way to Cure Cancer急性髓系白血病AMI，慢性淋巴性白血病CLL高表达CD19 Chimeric antigen receptors (CARs) are fusion proteins consisting of antigen recognition moieties and T-cell activation domains. CAR-modified T cells TCR-CD3Ø2.2.抗血管新生或抗转移制剂：抗血管新生或抗转移制剂： 抗血管内皮生长因子抗血管内皮生长因子VEGFVEGF抗体抗体( (AvastinAvastin, ,贝伐单贝伐单抗抗bevacizumab) )．也是第一个从抗体库中筛选出．也是第一个从抗体库中筛选出的的 FabFab 段抗体药物段抗体药物（５（５.２）抗体药物的主要作用领域－２）抗体药物的主要作用领域－免疫性疾病免疫性疾病Ø目前上市的用于目前上市的用于免疫性疾病免疫性疾病治疗者多达治疗者多达8 8种。

主要种主要通过结合免疫病理过程中的重要因子、阻断其功能通过结合免疫病理过程中的重要因子、阻断其功能而发挥作用而发挥作用ØTNFαTNFα在很多免疫性疾病中起到重要作用，所以成在很多免疫性疾病中起到重要作用，所以成为主要靶标为主要靶标HumiraHumiraØ20022002年美国批准上市的一个全人抗体药物年美国批准上市的一个全人抗体药物HumiraHumira( (阿达木单抗，阿达木单抗，雅培）通过结合雅培）通过结合TNFαTNFα治疗治疗早期的早期的类风湿性关节炎类风湿性关节炎RARAØ后又批准后又批准银屑病性关节炎．银屑病性关节炎．Ø0505年批准用於治疗牛皮癣所引发的关节炎年批准用於治疗牛皮癣所引发的关节炎Ø20072007年年2 2月，月，FDAFDA批准批准HumiraHumira增加新的适应症增加新的适应症CrohnCrohn病，目前是临床治疗病，目前是临床治疗CrohnCrohn病（节段性回肠炎）的病（节段性回肠炎）的唯一生物制药唯一生物制药Ø英国英国CAT公司与美国雅培公司研制公司与美国雅培公司研制 ØAdalimumab于于2003年年1月在美国上市，用于缓解抗月在美国上市，用于缓解抗风湿性药物治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿风湿性药物治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿性关节炎（性关节炎（RA）成年患者的体征与症状，并可避免）成年患者的体征与症状，并可避免Remicade引起的恶心和脱发等不良反应，引起的恶心和脱发等不良反应，Ø2006年批准用于缓解活动期强直性脊柱炎（年批准用于缓解活动期强直性脊柱炎（AS）患）患者的症状。

者的症状2007年年12月欧盟批准用于中至重度斑块月欧盟批准用于中至重度斑块型银屑病型银屑病2007年，年，FDA批准增加新的适应症批准增加新的适应症克隆病2008年被批准用于年被批准用于4岁及以上中重度活动性多关节型岁及以上中重度活动性多关节型幼年特发性关节炎（幼年特发性关节炎（JIA）患者 Remicade (Infliximab)类克克 Ø嵌合型抗体嵌合型抗体药物药物英利昔单抗英利昔单抗 RemicadeRemicade（强生，（强生，0202年，史上第一支抗类风湿性关节炎发炎因子的药物）年，史上第一支抗类风湿性关节炎发炎因子的药物）也是也是TNFαTNFα抗体，适应症是过敏性肠道疾患抗体，适应症是过敏性肠道疾患CrohnCrohn氏氏病ØRemicadeRemicade能与能与TNFaTNFa结合并中和结合并中和TNFaTNFa的生理活性的生理活性RemicadeRemicade还能够杀死合成还能够杀死合成TNFaTNFa的細胞后者是的細胞后者是RemicadeRemicade具有強有效的抑制具有強有效的抑制TNFaTNFa的作用机理的作用机理ØTNFaTNFa在在CrohnCrohn氏病和类风湿性关节炎中是引起和維氏病和类风湿性关节炎中是引起和維持炎症反应的主要因素持炎症反应的主要因素 Ø1999年被美国年被美国FDA批准上市，作批准上市，作为一种新型慢一种新型慢作用抗作用抗风湿湿药用于治用于治疗类风湿性关湿性关节炎，后逐炎，后逐渐应用于其他慢性自身免疫性疾病，如用于其他慢性自身免疫性疾病，如银屑病屑病性关性关节炎（炎（2002）、）、强强直性脊柱炎（直性脊柱炎（2004）、）、溃疡性性结肠炎（炎（2005）、成人克隆病（）、成人克隆病（2007）、）、幼儿克隆病（幼儿克隆病（2008）等）等 (5.3)(5.3)抗体药物的主要作用领域－抗体药物的主要作用领域－抗器官抗器官移植排斥反应移植排斥反应Ø抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。

预防排斥反应发生ØTcTc共有的分化抗原共有的分化抗原CD3CD3分子及分子及IL-2R IL-2R 对对T T细胞的细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗活化、增殖起重要作用，因此抗CD3CD3及抗及抗IL-2RIL-2R工程抗体的研究较为多见工程抗体的研究较为多见 （５（５.4 4）抗体药物的主要作用领域－感染性疾病）抗体药物的主要作用领域－感染性疾病Ø主要针对主要针对病毒感染病毒感染，帕利株单抗，帕利株单抗( (SynagisSynagis, palivizumabpalivizumab, , MedImmune 公司) 1998) 1998年被批准上年被批准上市市, ,第一株用于治疗病毒性疾病的人源化抗体第一株用于治疗病毒性疾病的人源化抗体, ,用于用于治疗儿童呼吸道融合病毒感染，治疗儿童呼吸道融合病毒感染，20042004年全球销售已年全球销售已近近1010亿美元Ø由于疫苗和小分子药物的竞争压力，用于感染性疾由于疫苗和小分子药物的竞争压力，用于感染性疾病治疗的抗体药物相对滞后病治疗的抗体药物相对滞后ØTNX-355 (TNX-355 (TanoxTanox公司公司) )是是CD4CD4抗体，具有阻断抗体，具有阻断HIVHIV进进入细胞的作用，目前已进入入细胞的作用，目前已进入3 3期临床。

如能成功上期临床如能成功上市，必将对小分子药物产生重大挑战市，必将对小分子药物产生重大挑战 Well-Characterized Monoclonal Antibody (B4) Well-Characterized Monoclonal Antibody (B4) directed against HIV receptor complex for directed against HIV receptor complex for treatment of HARRT resistant AIDS patients treatment of HARRT resistant AIDS patients through entry inhibitionthrough entry inhibitionØ新发传染病、慢性迁延性感染性疾病，以及病原新发传染病、慢性迁延性感染性疾病，以及病原体耐药性等不断出现的令人头痛的临床新问题有体耐药性等不断出现的令人头痛的临床新问题有可能会刺激对抗体药物研发的新热潮可能会刺激对抗体药物研发的新热潮（５（５.5 5）抗体药物的主要作用领域－）抗体药物的主要作用领域－血栓血栓Ø礼来公司开发的药物礼来公司开发的药物ReoPro(abciximabReoPro(abciximab) ) ØReoproReopro是一种糖蛋白是一种糖蛋白IIb/IIIaIIb/IIIa 抑制剂，主要用于抑制剂，主要用于预防进行冠脉血管成形术的患者发生缺血性心脏预防进行冠脉血管成形术的患者发生缺血性心脏病并发症的高危险性。

病并发症的高危险性 ØReoproReopro可预防凝血相关的并发症，临床已证明该可预防凝血相关的并发症，临床已证明该药可以减少病人的死亡率、心梗重复发作率、药可以减少病人的死亡率、心梗重复发作率、PCIPCI的重复进行等的重复进行等抗抗血小板凝集的原理图血小板凝集的原理图（６）抗体偶连（６）抗体偶连以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物治疗产业化开发的热点瘤生物治疗产业化开发的热点偶连细胞毒物质偶连细胞毒物质• 连接放射性同位素连接放射性同位素(131I、、99mTc锝锝 ））• 连接植物或细菌毒素（连接植物或细菌毒素（ricin、、PE40））• 连接细胞毒性药物（连接细胞毒性药物（C1027、、柔红霉素）柔红霉素）TUMORCELL-S-S-Fab免疫毒素免疫毒素( ( 植物和细菌植物和细菌 ) ) 同位素同位素( I( I131131, I, I125125, In, In111 111 ) ) 抗体导向化学疗法（甲氨喋呤抗体导向化学疗法（甲氨喋呤, ,长春新碱长春新碱, ,阿霉素）阿霉素）裂解药物的酶裂解药物的酶-S-S-６６.１放射性同位素标记的抗体治疗１放射性同位素标记的抗体治疗药物药物Ø放射免疫治疗（放射免疫治疗（RITRIT）是以能与肿瘤抗原结合的物）是以能与肿瘤抗原结合的物质如单克隆抗体，作为靶向载体，偶联放射性核素质如单克隆抗体，作为靶向载体，偶联放射性核素的肿瘤治疗药物注射入体内与肿瘤细胞相关抗原特的肿瘤治疗药物注射入体内与肿瘤细胞相关抗原特异结合达到对肿瘤杀伤而对正常组织损伤很小的一异结合达到对肿瘤杀伤而对正常组织损伤很小的一种治疗方法。

种治疗方法Ø放射性单抗放射性单抗——ZevalinZevalin（同位素钇（同位素钇9090和和CD20CD20单抗单抗 20022002年）治疗对年）治疗对rituxanrituxan耐药的低分化非耐药的低分化非HodgkinHodgkin淋淋巴瘤巴瘤是携带放射性同位素与癌细胞结合，然后释是携带放射性同位素与癌细胞结合，然后释放射线杀伤癌细胞放射线杀伤癌细胞 Ø1 1、、NHLNHL对射线高度敏感；对射线高度敏感；Ø2 2、抗体除了与肿瘤结合外，还能够非特异性地与、抗体除了与肿瘤结合外，还能够非特异性地与淋巴细胞结合放射免疫螯合物发出射线直接杀伤淋巴细胞结合放射免疫螯合物发出射线直接杀伤肿瘤细胞，甚至能够杀伤邻近抗体阴性的肿瘤细胞；肿瘤细胞，甚至能够杀伤邻近抗体阴性的肿瘤细胞；Ø3 3、抗体本身亦有强大抗肿瘤效应；、抗体本身亦有强大抗肿瘤效应；Ø4 4、淋巴瘤病人缺乏正常淋巴细胞及免疫力，发生、淋巴瘤病人缺乏正常淋巴细胞及免疫力，发生HAMAHAMA的几率较其它肿瘤低一般用鼠源性抗体作为的几率较其它肿瘤低一般用鼠源性抗体作为核素的载体，原因是其从体内清除的速度较人鼠嵌核素的载体，原因是其从体内清除的速度较人鼠嵌合抗体快，避免了正常器官及骨髓受到过量长期的合抗体快，避免了正常器官及骨髓受到过量长期的放射性照射放射性照射 Ø目前还没有最佳的适用于放射免疫治疗的同位素，目前还没有最佳的适用于放射免疫治疗的同位素，归纳下来，可用于治疗的核素有以下几种：归纳下来，可用于治疗的核素有以下几种：Ø131I131I，，90Y90Y，，111In111In，，125I125I，，99mTc99mTc，，212Bi212Bi，，153Sm153Sm，，177Lu177Lu，，211At211At，，32P32P，，186Re186Re，，67Cu67Cu。

Ø在非何杰金淋巴瘤治疗中常用的有在非何杰金淋巴瘤治疗中常用的有131I131I、、90Y90Y、、111In111InØ较为成熟且已经获得较为成熟且已经获得FDA FDA 批准正式用于临床的核批准正式用于临床的核素标记抗体包括：素标记抗体包括：( (ZevalinZevalin) )（须同时联用（须同时联用111In111In－－ibritumomabibritumomab  tiuxetantiuxetan以帮助显像），以帮助显像），131I-131I-anti-B1 anti-B1 抗体（抗体（BexxarBexxar）Ø其它核素标记抗体包括：其它核素标记抗体包括：1 1、、131I-LL2131I-LL2（抗（抗CD22CD22）LL2LL2结合结合CD22 CD22 后易于内在化而使后易于内在化而使131I131I很快代谢，很快代谢，131I131I在肿瘤内停留时间减少而影响疗效在肿瘤内停留时间减少而影响疗效Ø使用易于驻留的标记核素，如使用易于驻留的标记核素，如90Y90Y，对位于，对位于细胞内细胞内的抗原的抗原则更加有效则更加有效６６.２２抗癌药物偶联的抗癌药物偶联的抗体治疗药物抗体治疗药物Ø1.1.常用的抗癌药物：氨甲喋呤常用的抗癌药物：氨甲喋呤; ; 阿霉素阿霉素; ;丝裂霉素丝裂霉素; ;环磷酰胺环磷酰胺 ; ;新抑癌蛋白等。

新抑癌蛋白等Ø2.2.近年发现抗肿瘤抗生素近年发现抗肿瘤抗生素卡奇霉素卡奇霉素CalicheamicinCalicheamicin对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强10001000倍卡奇霉卡奇霉素素与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；20002000年美国年美国FDAFDA批准用于治疗免疫髓性白血病的批准用于治疗免疫髓性白血病的MylotargMylotarg（（奥唑米星，辉瑞奥唑米星，辉瑞 ））就是就是CD33CD33单抗与单抗与卡卡奇霉素奇霉素的偶联物售价：的偶联物售价：5mg,32005mg,3200美金20102010年年6 6月月自愿退出美国市场自愿退出美国市场3 3、抗体导向酶－前药疗法、抗体导向酶－前药疗法Ø前体药物前体药物（（ProPro- -drugdrug）是指该药物无治疗活性或仅）是指该药物无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；优点是可降低毒性和延长药物体内显示药物活性；优点是可降低毒性和延长药物体内的作用时间的作用时间。

Ø将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤肿瘤细胞位活化以杀伤肿瘤细胞Ø还在临床前研究阶段还在临床前研究阶段，现已有单抗碱性磷酸酶偶联现已有单抗碱性磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单抗物合并磷酸丝裂霉素，单抗- -胞嘧啶脱氨酶偶联物合胞嘧啶脱氨酶偶联物合并并5 5- -FuFu；在临床试验中取得了较好效果在临床试验中取得了较好效果-S-S-药物前体药物前体( (无毒无毒) ) 抗体与酶分子偶联抗体与酶分子偶联 Tumor cellenzyme抗体与酶分子偶联抗体与酶分子偶联 prodrugdrugenzymeMonoclonal antibodies as magic bullets(7)(7) 导向诊断药物导向诊断药物Ø导向药物是由单抗与放射性核素(诊断用)、毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定位点，发挥特意诊断和治疗作用OctreoScan(生长抑素受体显像技术生长抑素受体显像技术) in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate Monoclonal antibodies, which are specific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer, which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells大部分功能性内分泌肿瘤细胞富含生长抑素受体大部分功能性内分泌肿瘤细胞富含生长抑素受体 19941994年美国年美国FDAFDA批准批准111In111In铟铟 -DTPA-D-Phe1-octreotide-DTPA-D-Phe1-octreotide( (OctreoscanOctreoscan) )成为正式药品成为正式药品 Ø由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未在临床广泛应用。

以导向药物还未在临床广泛应用ØSFDASFDA批准进入临床的体内诊断用抗体批准进入临床的体内诊断用抗体• 131I-抗人肝癌单克隆抗体抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、、Hepama-1））• 99mTc（鍀）（鍀）-抗人小细胞肺癌单克隆抗体（抗人小细胞肺癌单克隆抗体（2F7））（（8）抗体药物作用原理）抗体药物作用原理Ø阻断和中和作用阻断和中和作用Ø诱导细胞凋亡诱导细胞凋亡Ø诱导抗独特型网络诱导抗独特型网络Ø补体介导的细胞毒补体介导的细胞毒Ø依赖抗体的细胞毒依赖抗体的细胞毒Ø影响信号传导影响信号传导Ø 免疫调节免疫调节Ø利用抗体的靶向性利用抗体的靶向性（（9）理想的抗体药物的性质）理想的抗体药物的性质Ø高特异性和高亲和力（高特异性和高亲和力（KdKd=108~1010L/M=108~1010L/M））Ø对人没有免疫原性，不诱导对人没有免疫原性，不诱导HAMAHAMA反应反应Ø游离抗体不激活补体游离抗体不激活补体Ø一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能Ø细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行Ø大规模培养大规模培养Ø抗体符合生物制品标准抗体符合生物制品标准生物制品（生物制品（抗体制品抗体制品））第一类：国内外尚未批准上市的生物制品。

第一类：国内外尚未批准上市的生物制品第二类：国外已批准上市，尚未列入药典或规程，第二类：国外已批准上市，尚未列入药典或规程，我国也未进口的生物制品我国也未进口的生物制品第三类：第三类：1 1、疗效以生物制品为主的新复方制剂疗效以生物制品为主的新复方制剂 2 2、工艺重大改革后的生物制品工艺重大改革后的生物制品第四类；第四类；1 1、国外药典或规程已收载的生物制品国外药典或规程已收载的生物制品 2 2、已在我国批准进口注册的生物制品已在我国批准进口注册的生物制品第五类：第五类：增加适应症的生物制品增加适应症的生物制品新药分类新药分类（（10）抗体药物：问题与挑战）抗体药物：问题与挑战l抗体药物研发进展迅速及竞争激烈的主要原因是：抗体药物研发进展迅速及竞争激烈的主要原因是：Ø1 1）抗体药物具有高度特异性，是靶向治疗的基础，）抗体药物具有高度特异性，是靶向治疗的基础，在这一方面远优于小分子药物；在这一方面远优于小分子药物；Ø2 2）抗体药物淘汰率仍明显低于小分子药物，临床转）抗体药物淘汰率仍明显低于小分子药物，临床转化率以及批准成功率都较高，以治疗癌症的抗体药物化率以及批准成功率都较高，以治疗癌症的抗体药物为例，其批准成功率为为例，其批准成功率为29%29%；；Ø3 3）抗体药物即使在专利保护到期后，由于其生产条）抗体药物即使在专利保护到期后，由于其生产条件的复杂性，也很难受到通用名药价格的威胁；件的复杂性，也很难受到通用名药价格的威胁；Ø4 4）更为重要的是已上市的抗体药物具有很高的市场）更为重要的是已上市的抗体药物具有很高的市场回报率，大大刺激了投资热情。

回报率，大大刺激了投资热情l但从但从药物经济学药物经济学的角度看，抗体药物并非很好的药的角度看，抗体药物并非很好的药物候选者物候选者Ø1.1.单抗是大分子糖蛋白，结构复杂、不利储存、不单抗是大分子糖蛋白，结构复杂、不利储存、不能口服、能口服、 进入体内进入体内5-75-7天才能到达靶位置天才能到达靶位置Ø2.2.抗体药物研发费用较高，达抗体药物研发费用较高，达10-1810-18亿美元，高于亿美元，高于小分子药物平均研发费的小分子药物平均研发费的9 9亿美元Ø3.3.抗体药物的单剂用量大，药物的质量标准高，生抗体药物的单剂用量大，药物的质量标准高，生产成本高昂，导致价格昂贵，以致被喻为产成本高昂，导致价格昂贵，以致被喻为““经济负经济负作用作用””以治疗肿瘤的抗体药物以治疗肿瘤的抗体药物AvastinAvastin为例，单为例，单个病人年度费用高达个病人年度费用高达5 5万美元万美元 抗体药物：问题与挑战抗体药物：问题与挑战 Ø抗体抗体靶抗原的不确定性靶抗原的不确定性，以及抗体自身的抗原性是，以及抗体自身的抗原性是主要问题之一由于人们对很多存在于靶细胞和组主要问题之一由于人们对很多存在于靶细胞和组织上的靶抗原的确切分布和功能并不完全了解，从织上的靶抗原的确切分布和功能并不完全了解，从而出现临床应用的很多不确定性，由此产生而出现临床应用的很多不确定性，由此产生安全安全问问题题 Ø抗体药物开发的第二个障碍是生产成本过高，以抗体药物开发的第二个障碍是生产成本过高，以 至成为至成为““富贵药富贵药””。

成本是抗体药物生产的一个瓶成本是抗体药物生产的一个瓶颈问题颈问题Ø同时也成为决定抗体药物未来发展的一个关键问题同时也成为决定抗体药物未来发展的一个关键问题因为，与其他科学技术发展的规律相同，具有巨大因为，与其他科学技术发展的规律相同，具有巨大市场前景的产品在遇到难以克服的瓶颈问题时，一市场前景的产品在遇到难以克服的瓶颈问题时，一定会刺激产生替代技术或物质定会刺激产生替代技术或物质 l技术上迈不过去的门槛技术上迈不过去的门槛Ø动物细胞大规模培养技术的高门槛动物细胞大规模培养技术的高门槛Ø在在8080年代，中国的单抗技术是与发达国家同步，年代，中国的单抗技术是与发达国家同步，没有代差，没有代差，Ø在在8080～～9090年代，研制出上百株有极高利用价值的年代，研制出上百株有极高利用价值的单抗可惜由于某些原因，这些单抗细胞株还冻单抗可惜由于某些原因，这些单抗细胞株还冻存在液氮罐中，没有转化成产品推向市场存在液氮罐中，没有转化成产品推向市场Ø国家抗体制药产业中曾经的思维错误国家抗体制药产业中曾经的思维错误欧美出现拮抗作用为主的新生物技术药物，而我欧美出现拮抗作用为主的新生物技术药物，而我国仍是以细胞因子等激动剂为主国仍是以细胞因子等激动剂为主Ø以治疗性抗体为代表的拮抗剂，在临床治疗中表现以治疗性抗体为代表的拮抗剂，在临床治疗中表现出副作用小、疗效好等突出特点。

而以细胞因子为出副作用小、疗效好等突出特点而以细胞因子为代表的激动剂，可开发的空间已极为有限，相反，代表的激动剂，可开发的空间已极为有限，相反，中和某些细胞因子的拮抗剂却成为欧美国家新药研中和某些细胞因子的拮抗剂却成为欧美国家新药研发的热点发的热点Ø美美FDAFDA至今还未批准至今还未批准TNF-αTNF-α上市，但批准了上市，但批准了3 3种中和种中和TNF-αTNF-α的抗体和融合蛋白，分别是嵌合抗体的抗体和融合蛋白，分别是嵌合抗体RemicadeRemicade、受体、受体- -FcFc融合蛋白融合蛋白EnbrelEnbrel和人源抗体和人源抗体HumiraHumiraØ由于有致瘤倾向，在美国没有批准由于有致瘤倾向，在美国没有批准EGFEGF进行临床试进行临床试验，但是拮抗验，但是拮抗EGFEGF的两种受体的两种受体EGFR IEGFR I和和EGFR IIEGFR II的的抗体抗体ErbituxErbitux和和HerceptinHerceptin都已获准上市都已获准上市Ø但我国却批准了但我国却批准了TNF-αTNF-α、、EGFEGF等上市，而拮抗它们等上市，而拮抗它们生物学活性的抗体还没有一个进入临床试验。

生物学活性的抗体还没有一个进入临床试验 Ø寻找寻找新的靶抗原新的靶抗原Ø基于抗原基于抗原立体结构设计立体结构设计抗体抗体Ø基于基于抗原抗原- -抗体相互作用设计抗体相互作用设计小分子抗体小分子抗体 模拟物模拟物（（11）今后抗体药物发展的方向）今后抗体药物发展的方向（（12）抗体药物研发新技术）抗体药物研发新技术l一、重组多克隆抗体药物一、重组多克隆抗体药物l富集人外周血富集人外周血B 细胞细胞,用单细胞用单细胞PCR 法钓取抗体基因法钓取抗体基因,构建构建噬菌体抗体库噬菌体抗体库,从抗体库中筛选出有功能的抗体基因从抗体库中筛选出有功能的抗体基因,克隆克隆到定点整合系统的载体上到定点整合系统的载体上,与重组酶表达载体一起共转染相与重组酶表达载体一起共转染相应的宿主细胞应的宿主细胞,筛选稳定表达抗体基因的细胞克隆筛选稳定表达抗体基因的细胞克隆,分别冻分别冻存根据需要混合若干克隆建成主细胞库和工作细胞库存根据需要混合若干克隆建成主细胞库和工作细胞库,与与常规主细胞库和工作细胞库不同的是它们由若干表达不同常规主细胞库和工作细胞库不同的是它们由若干表达不同抗体的来自同一母本细胞的细胞系混合而成。

目前抗体的来自同一母本细胞的细胞系混合而成目前,Symphogen 公司已经摸索了重组多抗的制备流程公司已经摸索了重组多抗的制备流程,初步验初步验证了进行工业化生产的可行性证了进行工业化生产的可行性全人抗体库的构建、筛选全人抗体库的构建、筛选l目前有许多方法可以克隆和分离抗原特异的人源抗体目前有许多方法可以克隆和分离抗原特异的人源抗体,例如在例如在噬菌体、酵母或核糖体上展示抗体噬菌体、酵母或核糖体上展示抗体,然后用抗原进行筛选然后用抗原进行筛选,获得获得特异性抗体这些方法依靠的都是抗体重链可变区与轻链可特异性抗体这些方法依靠的都是抗体重链可变区与轻链可变区的随机组合变区的随机组合,获得高亲和力抗体需要筛选大量克隆获得高亲和力抗体需要筛选大量克隆,而且筛而且筛选过程中可能出现偏向性丹麦选过程中可能出现偏向性丹麦Symphogen 公司发展了一公司发展了一种从人免疫球蛋白产生细胞中获取抗原特异性抗体库的方法种从人免疫球蛋白产生细胞中获取抗原特异性抗体库的方法,称为称为SymplexTM技术技术,该技术可以以高通量方式在单细胞水该技术可以以高通量方式在单细胞水平进行多重重迭延伸平进行多重重迭延伸PCR 获得的抗体轻、重链是天然配对的获得的抗体轻、重链是天然配对的,而且它们的库容和抗体多样性高于常规的噬菌体展示抗体库而且它们的库容和抗体多样性高于常规的噬菌体展示抗体库技术。

目前该技术已用于分离针对病毒技术目前该技术已用于分离针对病毒,如流感病毒、天花病如流感病毒、天花病毒、呼吸道合胞病毒毒、呼吸道合胞病毒,以及肿瘤抗原的抗体库以及肿瘤抗原的抗体库位点特异性整合技术位点特异性整合技术Ø位点特异性整合是通过重组酶识别基因组中特异性位点的位点特异性整合是通过重组酶识别基因组中特异性位点的特殊特殊DNA 序列序列,催化具有同源催化具有同源DNA 序列的基因插入这一特序列的基因插入这一特异位点Ø位点特异的整合技术使每次转染后抗体基因整合在同一染位点特异的整合技术使每次转染后抗体基因整合在同一染色体的同一位置色体的同一位置,大大降低了随机整合的位置效应位点特大大降低了随机整合的位置效应位点特异整合使抗体基因表达水平和细胞生长速率稳定异整合使抗体基因表达水平和细胞生长速率稳定,避免了表避免了表达某些抗体的细胞在生产过程中生长过度达某些抗体的细胞在生产过程中生长过度,每个抗体基因的每个抗体基因的遗传稳定性也保证了批间一致性因此遗传稳定性也保证了批间一致性因此,有可能使重组多克有可能使重组多克隆抗体符合隆抗体符合“一批一批”制备的要求制备的要求lSymphogen 公司建立的公司建立的Sym2pressTM技术技术,采采用了用了FRT/ FLP 重组酶系统重组酶系统,其他重组酶系统如其他重组酶系统如Cre/ lox 和和ΦC31 等同样可用。

等同样可用lhttp://www.fda.govllhttp://clinicaltrials.gov第二次作业：（第二次作业：（3周后交）周后交）抗体制药及抗体药物1.评分标准：85-100分（1）临床II-III期抗体药物综述或单独某一种II-III期抗体药物的制备，作用机理，专利权等（2）抗体药物制备的最新技术综述3）各大制药公司（全球排名前十）拥有的上市抗体药物及临床试验药物（综述）汇总 （4）从疾病分类（作用机理）分类，针对一类疾病的抗体药物（诊断）2.评分标准：70-85分已上市的抗体药物综述或某一种已上市的药物的制备，作用机理，专利权等3.评分标准：60-70分抗体制药一章的复习汇总，学习心得等 。