分离工程第八章.ppt

第八章 电泳本章主要知识点w w 电泳的概念电泳的概念w w 电泳的基本原理电泳的基本原理w w 电泳技术的分类电泳技术的分类w w 常用的凝胶电泳技术有哪些？常用的凝胶电泳技术有哪些？w w 电泳装置的基本组成电泳装置的基本组成w w 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程w w SDS-PAGESDS-PAGE电泳的基本原理及过程电泳的基本原理及过程w w 琼脂糖电泳的特点及其应用琼脂糖电泳的特点及其应用w w 等电聚焦电泳的基本原理等电聚焦电泳的基本原理w w 双相电泳的概念及其特点双相电泳的概念及其特点电泳的简单原理电泳的简单原理w w 蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液 中，它们的净电荷取决于介质的中，它们的净电荷取决于介质的H H+ +浓度或与浓度或与其它大分子的相互作用其它大分子的相互作用w w 带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子 尺寸大小尺寸大小和和形状形状、、分子所带电荷分子所带电荷或或分子的生分子的生 物学与化学特性物学与化学特性w 电泳：是荷电溶质在电场作用下发生定 向泳动的现象。

w 电泳分离是利用荷电溶质在电场中泳动 速度的差别进行分离的方法 w 20世纪初，电泳法用于蛋白质的分离， 20世纪70年代，电泳多用于分析目的w（1）自由电泳：是最早的一种电泳 形式，目前已很少使用w瑞典管内蛋白质溶液和 缓和液间有清晰可见界 面，然后加一电场，由 于界面处存在浓度梯度 因而产生折射梯度，利 用适当的光学系统可以 观察到界面的移动w 在电泳过程中，每个移动的界面相当于 某一特定的蛋白质，通过一定计算可得 其泳动度w 缺点：电泳中因通电发热等原因而引起 的对流，常回使已分离的溶质重新混合 ，为防止对流，可将电泳在多孔介质中 进行，称为区带电泳 w 区带电泳：应用支持介质的电泳，它表 示在一个电场的作用下，在某一支持物 上能将一个样品组成彻底分离成若干条 区带的过程w （2）区带电泳：在支持物上电泳时蛋 白质混合物被成若干区带 w 根据支持物物理性质的不同可分为4类 ： w 滤纸电泳和薄膜电泳，粉末电泳，细丝 电泳，凝胶电泳 w 多孔介质称为载体，应用最普通的是以 滤纸或凝胶为载体故称为纸电泳法或凝 胶电泳法第一节 凝胶电泳法w 凝胶电泳的作用是基于凝胶过滤作用（ 分子筛作用）和电泳淌度的双重机理， 所以它能获得较高的分辨率。

w 凝胶电泳：凝胶过滤作用（分子筛作用 ）电泳淌度正比于 电荷数（电荷效应）w 单位电场强度下的运动速度称为离子淌 度或迁移率聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分子筛效应w w 在在使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高使用凝胶介质的电泳中，由于电泳介质具有高 粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流，粘度和高的摩擦阻力，因此不仅可以防止对流， 而且可以把扩散减到最小而且可以把扩散减到最小w w 凝胶中的大分子分离取决于它的凝胶中的大分子分离取决于它的电荷电荷、、尺寸尺寸和和形形 状状w w 凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于凝胶的这种用于分离不同尺寸分子的特性是由于 它的尺寸筛分能力（它的尺寸筛分能力（Size sieving capacitySize sieving capacity），），这种这种 现象被称为现象被称为分子筛效应分子筛效应（（molecular sieving molecular sieving effecteffect））分子筛效应分子筛效应图中图中A A，，B B，，C C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MB>MCMA=MB>MC，，所带电荷量相同所带电荷量相同Q QA A=Q=QB B=Q=QC C。

ABC+-w 常用的凝胶材料：聚丙烯酰胺、琼脂糖 凝胶 w 聚丙烯酰胺（丙烯酰胺）单体是神经毒 素，可积累 w 凝胶电泳使用的凝胶种类和浓度根据分 离料液中溶质的相对分子质量而异w 聚丙烯酰胺含量 适用的分子量范围 w 7. 5%凝胶 10kD~1000kD w 3.5%凝胶 1000kD~5000kDw 琼脂糖或琼脂糖与聚丙烯酰胺混合物 >5000kDw 孔径从小到大垂直电泳槽及灌胶模具电泳的一般过程电泳的一般过程聚丙酰胺电泳凝胶电泳与凝胶过滤的区别w 在凝胶电泳中，样品混合物中各分子的 运动速度是小分子大于大分子物质，这 种凝胶过滤中的情况恰好相反，这是因 为在凝胶电泳中，系统里没有空隙体积 ，只有充满整体凝胶的网状骨架，因此 在其内部大分子物质不及小分子物质容 易移动常规聚丙烯酰胺凝胶电泳常规聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：原理：w w 由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE））是多孔介质，不是多孔介质，不仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小仅能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小 与生物大分子具有相似的数量级，与生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分能主动参与生物分 子的分离，具有分子筛效应子的分离，具有分子筛效应。

w w 因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时因此，在使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白质分离时 ，在电泳过程中，在电泳过程中不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取不仅取决于蛋白质的电荷密度，还取 决于蛋白质的尺寸和形状决于蛋白质的尺寸和形状w w PAGEPAGE可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳可以用圆盘电泳、垂直电泳或水平电泳电泳前的准备工作电泳前的准备工作w w 缓冲系统的选择：缓冲系统的选择：– –保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物 活性的保持；活性的保持；– –电泳时间和分辨率：从理论上讲电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGEPAGE可可 以在任何以在任何pHpH进行，但实际上过酸或过碱的进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）因此条件下将发生某种水解（脱酰胺）因此 ，，pHpH应限制在应限制在3~103~10之间缓冲系统的选择原则缓冲系统的选择原则w w 是两种标准的对立权衡是两种标准的对立权衡– –如果缓冲液的如果缓冲液的pHpH选择在远离样品中各种蛋白的选择在远离样品中各种蛋白的 等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳等电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳 时间短，区带细而窄；时间短，区带细而窄；– –如果缓冲如果缓冲pHpH选择在靠近被分离样品的一种或几选择在靠近被分离样品的一种或几 种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷种蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷 密度差别大，分辨率就高；密度差别大，分辨率就高；因此，常常选择因此，常常选择pH 8.0~9.5pH 8.0~9.5的缓冲，常用的缓冲的缓冲，常用的缓冲 液有液有TrisTris- -甘氨酸（甘氨酸（pH 8.3~9.5pH 8.3~9.5），），TrisTris- -硼酸硼酸(pH (pH 8.3~9.3)8.3~9.3)和和TrisTris- -醋酸（醋酸（pH 7.2~8.5pH 7.2~8.5））离子强度的选择离子强度的选择w w 离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电 泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。

能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝w w 一般选择缓冲液的离子强度为一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L0.01~0.1 mol/L之间之间凝胶浓度的选择凝胶浓度的选择w w 由于由于PAGEPAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度 ，而且取决于分子的大小、形状因此，与凝胶的，而且取决于分子的大小、形状因此，与凝胶的 分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳 速度）密切相关速度）密切相关 w w 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将 凝胶分为：凝胶分为：– –非排阻性凝胶（非排阻性凝胶（unrestrictive gelunrestrictive gel））: :浓度浓度0.7 0.7 ~1.0%~1.0%的琼脂糖凝胶；的琼脂糖凝胶；– –排阻性凝胶（排阻性凝胶（restrictive gelrestrictive gel））：：浓度大于浓度大于1%1%的的 琼脂糖凝胶和常规琼脂糖凝胶和常规PAGEPAGEw w 凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸 ，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样，电泳时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样位置；品仍留在加样位置；w w 凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种 蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到蛋白质分子均随缓冲液推进，不能得到 很好的分离；很好的分离；凝胶浓度凝胶浓度 (C=2.6%)(C=2.6%)分子量范围分子量范围 ( (kDakDa) )凝胶浓度凝胶浓度 (C=5%)(C=5%)分子量范围分子量范围 ( (kDakDa) )5 530~20030~2005 560~70060~700101015~10015~100101022~28022~280 151510~5010~50151510~20010~20020202~152~1520205~1505~150凝胶浓度与分子量测定的关系凝胶浓度与分子量测定的关系PAGEPAGE的具体操作过程的具体操作过程w w 制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度 和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；和缓冲液），使用灌胶模具灌胶；w w 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品 浓度（浓度（1~2mg/L1~2mg/L，，考染），加样（溴酚蓝）；考染），加样（溴酚蓝）；w w 电泳：电泳：4~64~6小时，待小时，待溴酚蓝溴酚蓝前沿到达阳极底部；前沿到达阳极底部；w w 检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250R-250、、银染色银染色 ——灵敏度比考染高灵敏度比考染高100100倍、荧光探针）；倍、荧光探针）；w w 照相、凝胶干燥：照相、凝胶干燥：w w 定量测定：定量测定：w 凝胶电泳：装柱操作，铺板操作。

w 近来聚丙烯酰胺凝胶电泳法有了两个新 进展： w A、不连续凝胶电泳 w B、十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺 凝胶电泳w 1、不连续凝胶电泳：w 不连续凝胶由两层组成，上层为浓缩层 （丙烯酰胺2~3%），下层为分离层（丙 烯酰胺5~25%）w 聚丙烯酰胺凝胶电泳：以聚丙烯酰胺为 支持物，制成凝胶柱 w 凝胶柱由二节凝胶组成（小节浓缩胶， 大节分离胶）这二节胶孔径大小，缓 冲液离子成分和离子强度值，电场强度 都是不同的w样品先被压缩一个薄层，然后进行 电泳 w一般经过三个效应，浓缩效应，分 子筛效应，电荷效应，使样品分离 效果好，分辨率高w 2、十二烷基硫酸钠（SDS)—聚丙烯酰 胺凝胶电泳 w 一种加阴离子去污剂—SDS的聚丙烯酰 胺凝胶电泳 w 主要用途： w 分离蛋白质和测定它的相对分子量SDS SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳w w 十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠- -聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳w w 主要用于测定蛋白质主要用于测定蛋白质亚基分子量亚基分子量以及未知蛋以及未知蛋 白质分子量的测定；白质分子量的测定。