蛋白质、多肽类药物质量控制.ppt

大大连市市药品品检验所所蛋白质、多肽蛋白质、多肽类药物质量控类药物质量控制制生化室生化室生化室生化室上海上海上海上海大大连市市药品品检验所所蛋白质、多肽类药物蛋白质、多肽类药物• •由由5050个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质，个以上的氨基酸组成的肽称为蛋白质，所以蛋白质和多肽没有明显的区别所以蛋白质和多肽没有明显的区别优点：生物活优点：生物活性高，特异性性高，特异性强，毒性低强，毒性低缺点：稳定缺点：稳定性差，容易性差，容易失活失活大大连市市药品品检验所所大分子，多组分大分子，多组分奥曲肽醋酸戈那瑞琳太难太难大大连市市药品品检验所所蛋白质、多肽药物质量控制蛋白质、多肽药物质量控制•1.1.鉴别鉴别•2.2.检查检查•3.3.含量测定含量测定大大连市市药品品检验所所1.1.鉴别鉴别• •1.11.11.11.1化学反应化学反应化学反应化学反应• •1.21.21.21.2高效液相色谱（保留时间）高效液相色谱（保留时间）高效液相色谱（保留时间）高效液相色谱（保留时间）• •1.31.31.31.3红外光谱（去氨加压素）红外光谱（去氨加压素）红外光谱（去氨加压素）红外光谱（去氨加压素）• •1.41.41.41.4紫外光谱紫外光谱紫外光谱紫外光谱• •1.51.51.51.5肽图分析（重组肽）肽图分析（重组肽）肽图分析（重组肽）肽图分析（重组肽）• •1.61.61.61.6核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林）核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林）核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林）核磁共振（缩宫素、戈舍瑞林）• •1.71.71.71.7毛细管电泳（重组肽）毛细管电泳（重组肽）毛细管电泳（重组肽）毛细管电泳（重组肽）• •1.81.81.81.8液质联用（去氨加压素）液质联用（去氨加压素）液质联用（去氨加压素）液质联用（去氨加压素）• •1.91.91.91.9圆二色光谱（测定蛋白质二级结构）圆二色光谱（测定蛋白质二级结构）圆二色光谱（测定蛋白质二级结构）圆二色光谱（测定蛋白质二级结构）• •1.101.101.101.10比旋度等比旋度等比旋度等比旋度等大大连市市药品品检验所所• •1.51.51.51.5肽图分析肽图分析肽图分析肽图分析• •《《《《中国药典中国药典中国药典中国药典》》》》2015201520152015年版四部通则年版四部通则年版四部通则年版四部通则3405340534053405肽图检查法肽图检查法肽图检查法肽图检查法• •第一法第一法第一法第一法胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解胰蛋白酶裂解————————反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法反相高效液相色谱法„„供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后，供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后，供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后，供试品和对照品用胰蛋白酶恒温水解，终止反应后，离心取上清。

液相离心取上清液相离心取上清液相离心取上清液相C C C C18181818或或或或C C C C8 8 8 8柱，柱，柱，柱，0.1%0.1%0.1%0.1%三氟乙酸的水和三氟乙酸的水和三氟乙酸的水和三氟乙酸的水和0.1%0.1%0.1%0.1%三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长三氟乙酸的乙腈梯度淋洗，检测波长214nm214nm214nm214nm• •第二法第二法第二法第二法溴化氰裂解溴化氰裂解溴化氰裂解溴化氰裂解——SDS——SDS——SDS——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳供试品图谱与对供试品图谱与对照品图谱进行比照品图谱进行比较，即得较，即得事实是基本做事实是基本做不出来一样的不出来一样的大大连市市药品品检验所所肽图分析存在的问题肽图分析存在的问题• •系统适用性在哪里？系统适用性在哪里？系统适用性在哪里？系统适用性在哪里？• •实验中复杂的前处理过程如何重现？实验中复杂的前处理过程如何重现？实验中复杂的前处理过程如何重现？实验中复杂的前处理过程如何重现？• •粗犷的规定如何统一判定尺度？粗犷的规定如何统一判定尺度？粗犷的规定如何统一判定尺度？粗犷的规定如何统一判定尺度？向抗生素和中药学习，规定特征峰，给向抗生素和中药学习，规定特征峰，给出标准图谱，去溶剂峰，引入相似度评出标准图谱，去溶剂峰，引入相似度评价，给出推荐色谱柱，给出积分条件，价，给出推荐色谱柱，给出积分条件，空白溶液制备方法等。

空白溶液制备方法等大大连市市药品品检验所所2.2.检查检查• •2.12.1氨基酸分析氨基酸分析• •2.22.2分子量与分子量分布分子量与分子量分布• •2.32.3有关物质有关物质• •2.42.4热原热原• •2.52.5残留溶剂残留溶剂大大连市市药品品检验所所2.12.1 氨基酸分析氨基酸分析• •2.1.12.1.12.1.12.1.1 酸水解酸水解酸水解酸水解• •6mol/L6mol/L6mol/L6mol/L盐酸，盐酸，盐酸，盐酸，110110110110℃℃℃℃，真空，，真空，，真空，，真空，20-2420-2420-2420-24小时优点：氨基酸不消旋优点：氨基酸不消旋缺点：色氨酸被完全破坏，缺点：色氨酸被完全破坏，天冬酰胺和谷氨酰胺完全水天冬酰胺和谷氨酰胺完全水解，胱氨酸不能直接测定解，胱氨酸不能直接测定大大连市市药品品检验所所2.12.1 氨基酸分析氨基酸分析• •2.1.22.1.22.1.22.1.2 碱水解碱水解碱水解碱水解• •5mol/L5mol/L5mol/L5mol/L氢氧化钠溶液，充氮封管，氢氧化钠溶液，充氮封管，氢氧化钠溶液，充氮封管，氢氧化钠溶液，充氮封管，110110110110℃℃℃℃，，，，22222222小时。

小时优点：色氨酸稳定优点：色氨酸稳定缺点：氨基酸外消旋化，多缺点：氨基酸外消旋化，多数氨基酸被破坏数氨基酸被破坏大大连市市药品品检验所所2.12.1 氨基酸分析氨基酸分析• •2.1.32.1.32.1.32.1.3 酶水解酶水解酶水解酶水解• •一组蛋白酶一组蛋白酶一组蛋白酶一组蛋白酶优点：条件温和，氨基优点：条件温和，氨基酸不消旋，不被破坏酸不消旋，不被破坏缺点：水解不完全缺点：水解不完全大大连市市药品品检验所所2.12.1 氨基酸分析氨基酸分析• •2.1.42.1.42.1.42.1.4 柱后衍生化柱后衍生化柱后衍生化柱后衍生化• •色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺）色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺）色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺）色谱柱分离后与衍生化试剂（茚三酮、荧光胺）反应优点：容易定量和自动化优点：容易定量和自动化操作缺点：灵敏度低，需要额外缺点：灵敏度低，需要额外设备，峰展宽，分辨率低设备，峰展宽，分辨率低大大连市市药品品检验所所2.12.1 氨基酸分析氨基酸分析• •2.1.52.1.52.1.52.1.5 柱前衍生化柱前衍生化柱前衍生化柱前衍生化• •氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基氨基酸先于化学偶联试剂（邻苯二甲醛、苯氨基甲酰等）反应，再分离检测。

甲酰等）反应，再分离检测甲酰等）反应，再分离检测甲酰等）反应，再分离检测优点：灵敏度高，分辨率优点：灵敏度高，分辨率高，普通高，普通HPLCHPLC即可分析即可分析缺点：部分衍生物不稳定，缺点：部分衍生物不稳定，副产物干扰分离检测副产物干扰分离检测大大连市市药品品检验所所番外篇番外篇————氨基酸类药物的有关物质研究氨基酸类药物的有关物质研究• •目前目前目前目前《《《《中国药典中国药典中国药典中国药典》》》》2015201520152015年版对于氨基酸年版对于氨基酸年版对于氨基酸年版对于氨基酸类制剂的杂质控制是类制剂的杂质控制是类制剂的杂质控制是类制剂的杂质控制是测定测定测定测定““““其他氨基酸其他氨基酸其他氨基酸其他氨基酸””””，采用，采用，采用，采用TLCTLCTLCTLC法喷茚三酮法喷茚三酮法喷茚三酮法喷茚三酮试液显色试液显色试液显色试液显色• •其他杂质如何控制？其他杂质如何控制？其他杂质如何控制？其他杂质如何控制？• •难点：种类多，分子难点：种类多，分子难点：种类多，分子难点：种类多，分子量小，弱紫外吸收，量小，弱紫外吸收，量小，弱紫外吸收，量小，弱紫外吸收，两性电解质，溶解性两性电解质，溶解性两性电解质，溶解性两性电解质，溶解性差异大。

差异大• •杂质来源：不稳定氨杂质来源：不稳定氨杂质来源：不稳定氨杂质来源：不稳定氨基酸，高温灭菌，生基酸，高温灭菌，生基酸，高温灭菌，生基酸，高温灭菌，生产工艺差距产工艺差距产工艺差距产工艺差距大大连市市药品品检验所所2.22.2 分子量与分子量分布分子量与分子量分布• •2.2.12.2.1分子排阻色谱分子排阻色谱大大连市市药品品检验所所2.22.2 分子量与分子量分布分子量与分子量分布• •2.2.22.2.2SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳大大连市市药品品检验所所2.22.2 分子量与分子量分布分子量与分子量分布• •2.2.32.2.3ESI-MSESI-MS大大连市市药品品检验所所2.22.2 分子量与分子量分布分子量与分子量分布• •2.2.42.2.4MALDI——TOFMALDI——TOF大大连市市药品品检验所所2.32.3 有关物质有关物质大大连市市药品品检验所所2.32.3 有关物质有关物质• •2.3.12.3.12.3.12.3.1 反相高效液相色谱反相高效液相色谱反相高效液相色谱反相高效液相色谱„„灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段。

灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段灵敏、快速、准确、廉价，目前最常用的手段• •2.3.22.3.22.3.22.3.2 毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳毛细管电泳„„消耗少，多种分离模式，操作简便消耗少，多种分离模式，操作简便消耗少，多种分离模式，操作简便消耗少，多种分离模式，操作简便• •2.3.32.3.32.3.32.3.3 液质联用液质联用液质联用液质联用„„特异性强，极高灵敏度特异性强，极高灵敏度特异性强，极高灵敏度特异性强，极高灵敏度• •2.3.42.3.42.3.42.3.4 高效分子排阻色谱高效分子排阻色谱高效分子排阻色谱高效分子排阻色谱„„用于高分子量蛋白物质检查用于高分子量蛋白物质检查用于高分子量蛋白物质检查用于高分子量蛋白物质检查大大连市市药品品检验所所2.42.4 热原热原• •2.4.12.4.12.4.12.4.1 家兔法家兔法家兔法家兔法„„兔子不稳定兔子不稳定兔子不稳定兔子不稳定• •2.4.22.4.22.4.22.4.2 鲎试剂鲎试剂鲎试剂鲎试剂„„只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖只能检测革兰氏阴性菌的酯多糖• •2.4.32.4.32.4.32.4.3 人全血细胞人全血细胞人全血细胞人全血细胞„„新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽。

新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽新鲜健康人全血哪来？实验员自己抽• •2.4.42.4.42.4.42.4.4 人源单核细胞系人源单核细胞系人源单核细胞系人源单核细胞系„„针对不同热原针对不同热原针对不同热原针对不同热原- - - -内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合内毒素、脂壁酸、酵母多糖等，更适合基质多样的生物大分子的热原检查基质多样的生物大分子的热原检查基质多样的生物大分子的热原检查基质多样的生物大分子的热原检查大大连市市药品品检验所所2.52.5 残留溶剂残留溶剂• •气相气相————顶空进样顶空进样• •最好不用液体进样，堵针，堵进样口最好不用液体进样，堵针，堵进样口• •不行就上气质联用不行就上气质联用大大连市市药品品检验所所3.3.含量测定含量测定• •3.13.13.13.1凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法• •3.23.23.23.2福林酚法福林酚法福林酚法福林酚法• •3.33.33.33.3双缩脲法双缩脲法双缩脲法双缩脲法• •3.43.43.43.4BCABCABCABCA法法法法• •3.53.53.53.5考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法• •3.63.63.63.6紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法• •荧光分光光度法荧光分光光度法荧光分光光度法荧光分光光度法• •3.83.83.83.8蛋白质印迹法蛋白质印迹法蛋白质印迹法蛋白质印迹法• •3.93.93.93.9高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法高效液相色谱法• •3.103.103.103.10毛细管电泳法毛细管电泳法毛细管电泳法毛细管电泳法• •3.113.113.113.11电位滴定法电位滴定法电位滴定法电位滴定法• •3.123.123.123.12效价测定效价测定效价测定效价测定• •3.133.133.133.13氨基酸比值氨基酸比值氨基酸比值氨基酸比值大大连市市药品品检验所所3.13.1 凯氏定氮法凯氏定氮法• •原理：原理：原理：原理：蛋白质与硫酸和催蛋白质与硫酸和催蛋白质与硫酸和催蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋化剂一同加热消化，使蛋化剂一同加热消化，使蛋化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫白质分解，分解的氨与硫白质分解，分解的氨与硫白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后酸结合生成硫酸铵然后酸结合生成硫酸铵然后酸结合生成硫酸铵然后在碱性条件下蒸馏将铵盐在碱性条件下蒸馏将铵盐在碱性条件下蒸馏将铵盐在碱性条件下蒸馏将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏转化为氨，随水蒸气蒸馏转化为氨，随水蒸气蒸馏转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸出来并为过量的硼酸液吸出来并为过量的硼酸液吸出来并为过量的硼酸液吸收，再以硫酸或盐酸标准收，再以硫酸或盐酸标准收，再以硫酸或盐酸标准收，再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，计算出样品中溶液滴定，计算出样品中溶液滴定，计算出样品中溶液滴定，计算出样品中的氮量由于蛋白质含氮的氮量由于蛋白质含氮的氮量由于蛋白质含氮的氮量由于蛋白质含氮量比较恒定，蛋白质含量量比较恒定，蛋白质含量量比较恒定，蛋白质含量量比较恒定，蛋白质含量= = = =含氮量含氮量含氮量含氮量/16%/16%/16%/16%，可由其氮，可由其氮，可由其氮，可由其氮量计算蛋白质含量量计算蛋白质含量量计算蛋白质含量量计算蛋白质含量大大连市市药品品检验所所3.13.1 凯氏定氮法凯氏定氮法大大连市市药品品检验所所3.23.2 福林酚法福林酚法• •原理：原理：原理：原理：在碱性条件下，蛋在碱性条件下，蛋在碱性条件下，蛋在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成络合物，白质与铜作用生成络合物，白质与铜作用生成络合物，白质与铜作用生成络合物，蛋白质中的酪氨酸和苯丙蛋白质中的酪氨酸和苯丙蛋白质中的酪氨酸和苯丙蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基将氨酸残基将氨酸残基将氨酸残基将FolInFolInFolInFolIn试剂中试剂中试剂中试剂中的磷钼酸盐的磷钼酸盐的磷钼酸盐的磷钼酸盐- - - -磷钨酸盐中磷钨酸盐中磷钨酸盐中磷钨酸盐中六价钨还原成深蓝色混合六价钨还原成深蓝色混合六价钨还原成深蓝色混合六价钨还原成深蓝色混合物。

在物在650nm650nm650nm650nm处的吸光度处的吸光度处的吸光度处的吸光度与蛋白质含量成正比与蛋白质含量成正比与蛋白质含量成正比与蛋白质含量成正比大大连市市药品品检验所所3.23.2 福林酚法福林酚法大大连市市药品品检验所所3.33.3 双缩脲法双缩脲法• •原理：原理：原理：原理：在强碱性溶液中，蛋白质肽键与在强碱性溶液中，蛋白质肽键与在强碱性溶液中，蛋白质肽键与在强碱性溶液中，蛋白质肽键与CuCuCuCu2+2+2+2+形成紫形成紫形成紫形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸组成无关蛋白质分子量及氨基酸组成无关蛋白质分子量及氨基酸组成无关蛋白质分子量及氨基酸组成无关测定肽键是真实测定肽键是真实测定肽键是真实测定肽键是真实的测定蛋白质的测定蛋白质的测定蛋白质的测定蛋白质大大连市市药品品检验所所3.33.3 双缩脲法双缩脲法大大连市市药品品检验所所3.43.4 BCABCA法法• •原理：原理：原理：原理：碱性条件下，蛋碱性条件下，蛋碱性条件下，蛋碱性条件下，蛋白质与白质与白质与白质与CuCuCuCu2+2+2+2+络合，并将络合，并将络合，并将络合，并将其还原成其还原成其还原成其还原成Cu+Cu+Cu+Cu+，，，，Cu+Cu+Cu+Cu+与与与与BCABCABCABCA试剂发生络合，使试剂发生络合，使试剂发生络合，使试剂发生络合，使其由原来的苹果绿形成其由原来的苹果绿形成其由原来的苹果绿形成其由原来的苹果绿形成稳定的紫蓝色复合物，稳定的紫蓝色复合物，稳定的紫蓝色复合物，稳定的紫蓝色复合物，在在在在562nm562nm562nm562nm处吸光度与蛋处吸光度与蛋处吸光度与蛋处吸光度与蛋白质浓度在广泛范围内白质浓度在广泛范围内白质浓度在广泛范围内白质浓度在广泛范围内有良好的线性关系。

有良好的线性关系有良好的线性关系有良好的线性关系二辛可宁酸二辛可宁酸二辛可宁酸二辛可宁酸大大连市市药品品检验所所3.43.4 BCABCA法法大大连市市药品品检验所所3.53.5 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法• •原理：原理：原理：原理：游离状态下呈红色游离状态下呈红色游离状态下呈红色游离状态下呈红色的有机染料，在稀酸溶液的有机染料，在稀酸溶液的有机染料，在稀酸溶液的有机染料，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸中与蛋白质的碱性氨基酸中与蛋白质的碱性氨基酸中与蛋白质的碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合和芳香族氨基酸残基结合和芳香族氨基酸残基结合和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，最大吸收波后变为蓝色，最大吸收波后变为蓝色，最大吸收波后变为蓝色，最大吸收波长从长从长从长从465nm465nm465nm465nm变为变为变为变为595nm595nm595nm595nmA A A A595595595595与蛋白质含量呈正比与蛋白质含量呈正比与蛋白质含量呈正比与蛋白质含量呈正比Coomassie brilliant Coomassie brilliant Coomassie brilliant Coomassie brilliant blue G-250blue G-250blue G-250blue G-250不能用石英杯不能用石英杯大大连市市药品品检验所所3.53.5 考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法大大连市市药品品检验所所3.63.6 紫外分光光度法紫外分光光度法• •原理：原理：原理：原理：酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有和色氨酸残基的苯环含有和色氨酸残基的苯环含有和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，在共轭双键，在共轭双键，在共轭双键，在280nm280nm280nm280nm处有处有处有处有吸收峰，吸光度与蛋白质吸收峰，吸光度与蛋白质吸收峰，吸光度与蛋白质吸收峰，吸光度与蛋白质含量成正比。

含量成正比含量成正比含量成正比大大连市市药品品检验所所紫外分光光度法紫外分光光度法大大连市市药品品检验所所3.73.7 荧光分光光度法荧光分光光度法• •原理：原理：原理：原理：当溶液中含有表面当溶液中含有表面当溶液中含有表面当溶液中含有表面活性剂时，荧光染料分子活性剂时，荧光染料分子活性剂时，荧光染料分子活性剂时，荧光染料分子之间通过疏水相互作用形之间通过疏水相互作用形之间通过疏水相互作用形之间通过疏水相互作用形成二聚体或多聚体，多聚成二聚体或多聚体，多聚成二聚体或多聚体，多聚成二聚体或多聚体，多聚体的形成导致荧光强度降体的形成导致荧光强度降体的形成导致荧光强度降体的形成导致荧光强度降低然后加入蛋白质溶液，低然后加入蛋白质溶液，低然后加入蛋白质溶液，低然后加入蛋白质溶液，导致多聚体解聚而使荧光导致多聚体解聚而使荧光导致多聚体解聚而使荧光导致多聚体解聚而使荧光强度增加在一定蛋白质强度增加在一定蛋白质强度增加在一定蛋白质强度增加在一定蛋白质浓度范围内，荧光信号强浓度范围内，荧光信号强浓度范围内，荧光信号强浓度范围内，荧光信号强度与蛋白质的浓度成正比度与蛋白质的浓度成正比度与蛋白质的浓度成正比。

度与蛋白质的浓度成正比大大连市市药品品检验所所荧光分光光度法荧光分光光度法大大连市市药品品检验所所3.83.8 蛋白质印迹法蛋白质印迹法• •原理：原理：原理：原理：将混合蛋白质进行将混合蛋白质进行将混合蛋白质进行将混合蛋白质进行电泳分离，将产物电转移电泳分离，将产物电转移电泳分离，将产物电转移电泳分离，将产物电转移到硝酸纤维膜上，到硝酸纤维膜上，到硝酸纤维膜上，到硝酸纤维膜上，以固相以固相以固相以固相载体上的蛋白质或多肽作载体上的蛋白质或多肽作载体上的蛋白质或多肽作载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起为抗原，与对应的抗体起为抗原，与对应的抗体起为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位免疫反应，再与酶或同位免疫反应，再与酶或同位免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，素标记的第二抗体起反应，素标记的第二抗体起反应，素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显经过底物显色或放射自显经过底物显色或放射自显经过底物显色或放射自显影检测蛋白成分影检测蛋白成分影检测蛋白成分影检测蛋白成分大大连市市药品品检验所所3.83.8 蛋白质印迹法蛋白质印迹法大大连市市药品品检验所所3.93.9 高效液相色谱法高效液相色谱法• •原理：原理：原理：原理：酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在酪氨酸，苯丙氨酸和色氨酸残基在280nm280nm280nm280nm处处处处有紫外吸收，吸光度与蛋白质含量成正比。

反相有紫外吸收，吸光度与蛋白质含量成正比反相有紫外吸收，吸光度与蛋白质含量成正比反相有紫外吸收，吸光度与蛋白质含量成正比反相HPLCHPLCHPLCHPLC可以分析多肽，更大分子量的多肽需要用凝可以分析多肽，更大分子量的多肽需要用凝可以分析多肽，更大分子量的多肽需要用凝可以分析多肽，更大分子量的多肽需要用凝胶过滤色谱柱胶过滤色谱柱胶过滤色谱柱胶过滤色谱柱大大连市市药品品检验所所3.93.9 高效液相色谱法高效液相色谱法大大连市市药品品检验所所3.103.10毛细管电泳法毛细管电泳法• •原理：原理：原理：原理：以毛细管作为分离通道，高压直流电场以毛细管作为分离通道，高压直流电场以毛细管作为分离通道，高压直流电场以毛细管作为分离通道，高压直流电场驱动，按照毛细管中淌度、分配系数不同进行驱动，按照毛细管中淌度、分配系数不同进行驱动，按照毛细管中淌度、分配系数不同进行驱动，按照毛细管中淌度、分配系数不同进行分离的新型液相技术分离的新型液相技术分离的新型液相技术分离的新型液相技术大大连市市药品品检验所所3.103.10毛细管电泳法毛细管电泳法大大连市市药品品检验所所谢谢！谢谢！韩春晖韩春晖韩春晖韩春晖。