H2O2诱导人肝细胞应用萝卜硫素对氧化应激损伤的保护价值.docx

H2O2诱导人肝细胞应用萝卜硫素对氧化应激损伤的保护价值文题释义：抗氧化防御体系：分为酶系和非酶系，酶系主要包括超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶、硫氧蛋白还原酶等；非酶系包括具有还原性的巯基蛋白如金属硫蛋白、谷胱甘肽及维生素E等萝卜硫素：作为一种具有抗氧化损伤的天然活性成分，已在多种疾病的防治中发挥着重要的生物学作用萝卜硫素对肝脏功能具有很好的保护作用，能降低聚乙二醇诱导的肝细胞毒性，起着保肝、护肝的功效缩略语：核因子E2相关因子2:nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2,Nrf2引言早期研究提示氧化应激(OS)在肝脏疾病中发挥着重要的生物学效应[1]，氧化损伤可降低生物膜功能、或和生物大分子结合降低酶活性等导致不同程度肝损伤[2]氧化应激损伤会促使炎症因子的产生，导致肝细胞损伤[3]活性氧(ROS)的过度积累是氧化应激损伤的主要表现形式之一，而且活性氧在介导慢性肝炎发生发展过程中起着非常重要的生物学作用[4]早期已有研究证实核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的活化能调控细胞氧化应激损伤发生[5]因此，研究Nrf2信号传导在人肝细胞(LO2细胞)损伤中的作用具有重大意义。

萝卜硫素(SFN)广泛分布于十字花科植物，并且其在抗氧化方面表现出较强的药理活性[6,7]肝损伤过程中伴随着严重的氧化应激过程，然而萝卜硫素对肝脏氧化应激损伤的保护作用研究较少，基于此，实验着重探讨了萝卜硫素对LO2细胞氧化应激损伤的保护作用，及其对Nrf2信号传导活化的影响1、材料和方法1.1设计细胞学实验观察1.2时间及地点实验于2017年6月至2018年5月在恩施土家族苗族自治州中心医院中心试验室完成1.3材料1.3.1细胞和药物人肝细胞系LO2购买于上海纪宁公司；萝卜硫素(杭州林格贝公司,批号：20171106-2，纯度≥98%)1.3.2实验用主要试剂RPMI1640培养基(Gibco公司)；胎牛血清(Gibco公司)；CCK8试剂盒(上海威奥公司，批号：CJ-150-25)；丙二醛试剂盒(上海恒远公司，批号：SHP-1230-24)；一氧化氮试剂盒(江苏泽雨公司，批号：HTC-4203-54)；超氧化物歧化酶SOD试剂盒(北京默沙克公司，批号：SJ-1540-93);BCA试剂盒(北京索莱宝公司，批号：C15740);SDS-PAGE凝试剂盒(江苏泽雨公司，批号：20170512)；β-actin、Histone、Nrf2、GCLC、NQO1及血红素加氧酶(HO-1)一抗均(美国Sigma公司)；对应二抗(Abcam公司)。

1.3.3仪器HBS-1096A酶标仪(南京德铁仪器公司)；SANYO细胞培养箱(美国BIO-RAD);BIO-RAD成像系统(美国)研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和恩施土家族苗族自治州中心医院对研究的相关伦理要求1.4实验方法1.4.1LO2细胞处理LO2细胞(1×108L-1)采用RPMI1640培养基进行传代培养，恒温37℃、体积分数5%CO2浓度待细胞生长至90%左右时，用无菌PBS清洗2次，0.25%胰酶-0.125%EDTA消化，收集细胞重悬，以1∶3比例传代培养1.4.2细胞增殖检测将细胞悬液(1×104/孔)接种于96孔板，分为对照组、H2O2诱导组、H2O2+低剂量萝卜硫素组(10μmol/L)、H2O2+中剂量萝卜硫素组(20μmol/L)、H2O2+高剂量萝卜硫素组(40μmol/L)采用100μg/L的H2O2处理人肝细胞24h，诱导细胞氧化应激损伤；H2O2+萝卜硫素组将100μg/L的H2O2与不同浓度萝卜硫素同时处理细胞24h，进行后续实验萝卜硫素给药剂量参照文献[11]研究结果确定的低、中、高3种剂量培养24h后吸干旧培养液，每孔加入10μLCCK8试剂，继续于37℃、体积分数5%CO2条件下培养1h，然后在450nm处测定细胞吸光度A值，然后计算细胞相对存活率。

细胞相对存活率(%)=A药物组/A对照组×100%1.4.3氧化应激相关指标检测将细胞悬液接种于6孔板，按“1.4.2”项将细胞分组干预，于37℃、体积分数5%CO2条件下培养24h后，将细胞裂解成匀浆，然后按照试剂盒操作方法检测丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性1.4.4WesternBlot法检测核蛋白Nrf2及组织GCLC、NQO1及HO-1蛋白表达按“1.4.3”项收集细胞，提取核Nrf2蛋白具体步骤如下：将收集的细胞用2mLBufferA溶液重悬、离心、弃上清；在加入1mLBufferA溶液重悬细胞，冰上放置10min；将悬液转入玻璃匀浆器，研磨5组，每组转15圈；1000×g/min,4℃下离心10min，此时上清为胞浆，可留样做后面的鉴定；将沉淀重悬于3倍体积的BufferN，并将其轻轻覆盖于2体积的BufferB上；1000×g/min,4℃下离心10min；离心之后可看见管底和管中部液面分界处各有一沉淀，中部的沉淀即为核；再用PBS重悬中间沉淀，1500×g/min低温离心10min，以洗去杂质，洗2遍，沉淀即为胞核另收集细胞提取总的GCLC、NQO1及HO-1蛋白。

采用BCA试剂盒检测蛋白浓度后，上样进行凝胶电泳每孔上样量50μg,70V电泳3h，然后275mA恒流进行电转90min，完成后用5%脱脂奶粉封闭1h，切割目的蛋白条带将条带放入对应的β-actin、Histone、Nrf2、GCLC、NQO1及HO-1一抗溶液(稀释比均为1∶1000)中，反应过夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP标记IgG二抗溶液(稀释比为1∶3000)室温反应1h,TBST洗膜3次，每次10min,ECL显色进行蛋白条带曝光采用Image软件分析蛋白灰度值1.5主要观察指标(1)各组LO2细胞增殖情况及存活率；(2)LO2细胞匀浆中丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性；(3)LO2细胞核中Nrf2蛋白表达；(4)LO2细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达1.6统计学分析运用SPSS20.0软件进行数据处理，数据采用呈现，组间比较采用单因素方差分析检验，多组间计量资料采用单因素方差分析和LSD检验比较，P<0.05为差异有显著性意义2、结果2.1萝卜硫素对LO2细胞增殖的影响实验检测发现，H2O2刺激可以降低LO2细胞相对存活率(P<0.01)；当采用低、中、高3种不同剂量萝卜硫素干预后，LO2细胞的增殖情况得到明显改善(P<0.05)，且3种剂量萝卜硫素组LO2细胞存活率差异有显著性(t=6.327,P<0.01)，表现出剂量依赖性。

见表1表1LO2细胞存活率的变化2.2萝卜硫素对LO2细胞匀浆中丙二醛、一氧化氮水平及超氧化物歧化酶活性影响见表2,H2O2干预能促使LO2细胞释放丙二醛、一氧化氮，而抑制超氧化物歧化酶活性(P<0.01)；当采用低、中、高3种不同剂量萝卜硫素干预后，LO2细胞氧化应激损伤程度得到很好的改善(P<0.05)，表现在丙二醛、一氧化氮水平降低，超氧化物歧化酶活性升高，且3种剂量萝卜硫素组丙二醛(t=3.269,P<0.05)、一氧化氮(t=4.025,P<0.01)水平及超氧化物歧化酶(t=9.314,P<0.001)活性差异均有显著性意义表2各组丙二醛、一氧化氮和超氧化物歧化酶水平的变化(n=6)2.3萝卜硫素对Nrf2信号传导的影响H2O2干预能抑制Nrf2向核内转移，提示经不同浓度萝卜硫素处理后，能明显促使Nrf2向核内转移(P<0.05)，且3种剂量萝卜硫素组LO2细胞核中Nrf2蛋白表达差异有显著性意义(t=8.037,P<0.001)图1萝卜硫素对核因子E2相关因子2(Nrf2)核转位的影响(n=6)2.4萝卜硫素上调GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达H2O2干预LO2细胞能明显抑制GCLC、NQO1和HO-1蛋白表达(P<0.01)；随着不同剂量的萝卜硫素干预后，细胞中GCLC、NQO1和HO-1蛋白的表达显著升高(P<0.05)，且3种剂量萝卜硫素组GCLC(t=5.514,P<0.01)、NQO1(t=10.208,P<0.001)及HO-1(t=6.320,P<0.01)表达水平差异有显著性。

见图23、讨论氧化应激水平提示肝细胞中活性氧的产生及清除的稳态失衡，活性氧积累造成肝损伤肝细胞线粒体、微粒体及氧化酶体都能够生成活性氧，主要以线粒体生成量居多在清除活性氧体系中包含抗氧化酶、小分子抗氧化物质及具有抗氧化作用的Ⅱ相代谢酶，细胞中均依靠它们来维持氧化还原的稳态在机体病理状态下活性氧过量生成，超过了抗氧化系统清除能力，引起肝功能障碍、肝细胞坏死，导致肝脏再生障碍[8,9]H2O2作为一种促氧化剂是由于本身表现出氧化作用，还能够引起活性氧的过量产生而导致蛋白质及脂质的过氧化损伤，常用于诱导氧化应激损伤模型[10]此次实验采用H2O2成功构建LO2细胞氧化损伤模型，能作为后续实验的研究对象图2萝卜硫素对GCLC、NQO1和血红素加氧酶1(HO-1)蛋白的影响(n=6)萝卜硫素作为一种具有抗氧化损伤的天然活性成分[6,7]，已在多种疾病的防治中发挥着重要的生物学作用此次实验结果也发现萝卜硫素可以很好地改善H2O2诱导的氧化损伤，主要通过抑制丙二醛、一氧化氮的产生及超氧化物歧化酶活性来实现前期预实验结果发现萝卜硫素给药剂量在5-60μmol/L范围内对LO2细胞没有明显毒性作用，并参照早期相关研究的结果[11]，最终确定此次实验萝卜硫素的低、中、高3种剂量。

相关研究也提出，萝卜硫素对肝脏功能具有很好的保护作用，包括上调肝组织中药物代谢酶的活性[12]，还能降低肝脏中葡萄糖的产生，进而降低了2型糖尿病发生的风险[13]萝卜硫素还能降低聚乙二醇诱导的肝细胞毒性[14]，起着保肝、护肝的功效另外，萝卜硫素对哺乳期暴露于铅的鼠海马区的氧化损伤也表现出较好的药理作用，主要抑制了海马组织丙二醛的产生及诱导了超氧化物歧化酶活性[15]早期发现萝卜硫素对缺血/再灌注肝损伤具有显著的保护作用，主要通过抑制肝细胞凋亡来发挥保护作用[16]然而，萝卜硫素在保肝护肝中的作用机制还处于初步研究阶段其中Nrf2信号传导是介导氧化应激反应最经典的通路，当Nrf2磷酸化后与Keap1相互结合转入至细胞核，从而结合到ARE序列编码相关靶基因的转录[17,18]早期研究也证实萝卜硫素能通过激活Nrf2信号传导抑制多种炎症小体的活化[19]，还能诱导肿瘤细胞凋亡[20]Nrf2是调节氧化还原稳态的关键转录因子之一[21,22]，可调控氧化应激相关酶类包括谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)[23]、NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO1)及血红素加氧酶(HO-1)的基因表达[24,25]，从而对抗环境中有害物质引起的氧化应激反应。

在衰老和氧化应激过程中，萝卜硫素能通过诱导Nrf2/ARE/PRDX6信号通路活性，使细胞的抗氧化防御能力重新激活[26]此次研究发现萝卜硫素能诱导Nrf2向细胞核内转移，进而转录GCLC、NQO1及HO-1等基因表达文章缺乏对Nrf2下游通路ARE/PRDX6活化的作用，于是会在后续实验中考察萝卜硫素对Nrf2/ARE/PRDX6信号通路活性的影响实验结果发现H2O2能明显抑制Nrf2向细胞核内的转移，加快了LO2细胞氧化损伤的发展；而萝卜硫素能显著缓解H2O2的这种抑制作用，促使Nrf2向细胞核内的转移，并上调GCLC、NQO1及HO-1蛋白的水平总之，萝卜硫素能很好的改善LO2细胞的氧化损伤，可能与Nrf2。