金属离子螯合琼脂糖凝胶的制备.doc

范文最新推荐------------------------------------------------------1 / 10金属离子螯合琼脂糖凝胶的制备摘要目前蛋白质组学这一领域刚开始趋于成熟，而开展蛋白质组学研究首先要把蛋白质从复杂的大分子混合物中分离纯化出来蛋白质纯化方法中的固定化金属亲合层析（IMAC）法发展迅猛IMAC 是利用金属离子与氨基酸残基的配位作用，选择性地纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质由于固定化金属亲合层析技术操作简单，吸附容量大，选择性比较好，成本低廉，已经成为分离纯化蛋白质的有效工具但因用于分离蛋白质的凝胶介质机械强度差、扩散传质慢,分离操作只能在低流速下进行 ,限制了其在大规模蛋白质分离纯化中的应用因此，选择合适的凝胶介质是提高纯化技术的关键本具体研究内容如下：1.以琼脂糖凝胶(Sepharose CL-6B)作为载体，环氧氯丙烷为活化剂，分别以羧甲基天冬氨酸和亚氨基二乙酸为螯合配基，制备亲和层析介质 Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+和 SepharoseCL-6B-CM-ASP-Co2+2.将制备好的 Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+和Sepharose-CM-ASP-Co2+介质用于纯化小规模六聚组氨酸融合蛋白，与商业化产品 Ni-NTA 介质进行比较，通过 SDS-PAGE 分析可知：Ni-IDA 介质纯化效果最好，优于 CM-ASP-Co2+介质和商业化产品 Ni-NTA介质，纯化后目标蛋白几乎没有杂质，蛋白经过一次提纯就可得到纯度高的靶向蛋白。

制备好的 Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+介质可商业化，用于纯化大规模的组氨酸蛋白11884关键词金属螯合层析琼脂糖凝胶蛋白质纯化毕业设计说明书（论文）外文摘要TitlePreparation of Metal Ion Chelating Sepharose Gel ---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------3 / 102.1 试剂与仪器 112.2 Ni2+离子螯合琼脂糖凝胶介质的制备 122.3 Co2+离子螯合琼脂糖凝胶介质的制备 133 金属离子螯合琼脂糖凝胶介质的比较 153.1 DNA 聚合酶的纯化 153.2 自制 Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+，Sepharose-CM-ASP-Co2+介质与商业化 Ni-NTA 介质比较 164 结果与讨论 174.1 金属离子螯合琼脂糖凝胶介质的表征 174.2 Sepharose CL-6B-IDA-Ni2+和 Sepharose CL-6B-CM-ASP-Co2+介质 螯合金属离子量的测定 214.3Ni2+亲和层析介质的影响因素 214.4 螯合树脂最大纯化量 234.5 凝胶介质的比较与选择 24结论 26致谢 27参 考 文 献 281 绪论1.1 蛋白质纯化技术简介近年来，随着基因工程的快速发展，纯化蛋白的方法的需要提高。

蛋白质由于其自身的大小、溶解度和所带电荷不同，纯化的方法也各不相同[1]分离纯化---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------5 / 10蛋白质的方法有很多种[2]，如盐析法，电泳法，亲和层析法，膜色谱法等等1.1.1 盐析法蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加, 此为盐溶; 当盐浓度继续上升时, 蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出, 此为盐析, 从而达到分离纯化的效果盐析法是最原始的提纯方法之一，一般粗抽提物常用该法进行粗分，显然，这已经远远不能满足当今的纯化要求1.1.2 电泳法电泳为带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象蛋白质混合样品经过电泳后, 被分离的各蛋白质组分的电泳迁移率互不相同, 由各蛋白质组分所带的静电荷以及分子大小和形状的不同而达到分离这是根据蛋白质的带电性质不同而发展的分离技术常用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 毛细管电泳 [3]。

翁瑜等 [4]发现双向凝胶电泳提取蛋白质效果更好 1.2 固定化金属亲和层析1975 年， Porath[8]等人提出了一种新的纯化方法——固定化金属螯合层析(Immobilized metal chelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子（Ni2+，Cu2+等）与氨基酸表面的残基的配位螯合作用来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质固定化亲和层析技术利用靶蛋白与金属离子间的强大亲和力来纯化蛋白质各种配体比如 IDA（亚氨基二乙酸） ，次氨基三乙酸（NTA）常被用与金属离子结合，固定在固相载体上1975 年以来，这种方法已被广泛应用，是纯化重组蛋白的首选方法氨基酸中，组氨酸最常用，易被金属离子吸附组氨酸的表面含有大量的咪唑基，α-氨基和羧基，这些基团可以与金属离子形成环状结构，使蛋白质与金属离子结合紧密随着研究的不断深入，固定化金属亲和层析法的选择性也不断提高，实验程序得到优化，实验成本也有所降低，是纯化蛋白的优良方法范文最新推荐------------------------------------------------------7 / 101.2.1 固定化金属亲和层析的原理固定化金属亲和层析是利用蛋白质对分子的特异性识别来达到提纯的目的。

其原理在于同蛋白质结合的金属离子一般含有空轨道，能够与氧、氮等原子配位，而在溶液中，这些空轨道一般与水分子结合当用来纯化蛋白质时，蛋白质表面的基团可以提供电子，与金属离子的空轨道结合，作用力强，蛋白质即会与金属离子结合形成螯合物[9]这些与金属离子紧密结合的蛋白质在亲和层析柱中的流动受阻，而其他杂质蛋白则快速流出，再利用洗脱液洗脱掉吸附的蛋白，就可以达到纯化蛋白的目的金属离子如 Ni2+，Co2+等都可用来与蛋白结合下图以 Ni2+为例，以亚氨基二乙酸（IDA）为螯合配基来说明纯化蛋白的原理（如图 1.1） 图 1.1 IMAC 的工作原理示意图 黑色的圆球状代表固相载体，以图为例说明纯化蛋白质的步骤： 图 1.4 基质的活化（1）环氧基法：采用环氧氯丙烷法 [12]作为活化剂，这种方法使用广泛，原因是环氧氯丙烷活化方便，价格便宜，操作上也简单，工艺成熟，毒性也很低，实用性强，关键是偶联配基很牢固一般先将基质用水洗，然后加入环氧氯丙烷进行活化在此过程中添加一定量的 NaOH 和二甲基亚砜（DMSO ）[13] 溶液，可以促进活化反应的进行，提高活化效率2）二氯亚砜法：二氯亚砜是一种羧基氯化试剂，在反应体系中，需要加入大量二氯亚砜，一般在65℃下进行反应，反应时间 5h~6h，反应机理如图1.5 所示。

这种活化体系要求无水无氧，条件非常苛---------------------------------------------------------------范文最新推荐------------------------------------------------------9 / 10刻，实施起来繁琐，而且活化效率很低1.5 二甲亚砜活化基质的反应机理在活化琼脂糖凝胶的方法中，还有溴化氰法，羧基二亚胺法等等本文主要研究环氧氯丙烷法活化琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶介质是最常用的固相载体，琼脂糖表面含有大量的-OH 基团，容易发生活化反应，另外琼脂糖凝胶还具有毒性低、生物相容性好等优点1.2.3.2 螯合配基配基在分离中起特异性吸附目标分离物的作用, 是亲和层析的核心物质常见的螯合配基有：亚氨基二乙酸（IDA） ，次氨基三乙酸（NTA） ，三羧甲基乙二胺（TED） ，具体结构如图 1.6亚氨基二乙酸：三个与金属离子相互作用的位点，与金属离子之间的作用力较强，与蛋白质结合紧密；次氨基三乙酸：四个金属离子相互作用的位点，四个与蛋白质作用的位点；三羧甲基乙二胺：与蛋白质作用力弱，只有一个位点与蛋白质作用。

本文主要研究纯化组氨酸标签蛋白的镍柱，一般用来纯化组氨酸标签（His）蛋白的镍柱有两种：Ni-NTA（氮川三乙酸）和 Ni-IDA Ni-NTA：这种螯合剂可通过四个结合点与 Ni2+结合形成螯合物，从而纯化带有 His 标签的融合蛋白，且不会发生 Ni2+渗漏Ni-IDA 的高亲和力层析柱可用于纯化多种重组表达系统的表达产物，如细菌、酵母、昆虫等表达系统表达的 His 标签标记的融合蛋白，Ni2+通过三个结合位点与三齿螯合剂（亚氨基二乙酸）共价偶联 Ni-IDA 可在天然、变性或杂交条件下纯化 His 标签重组蛋白，结合到柱子上的蛋白，用低 pH 缓冲液或咪唑溶液、甚至组氨酸溶液都可洗脱下来，实施起来比较容易，应用也很广泛本文主要研究 Ni-IDA纯化柱 。