PCR测定中常见问题分析课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,测定中常见问题分析,卫生部临床检验中心,王露楠,核酸检测过程,2,分析后,采集容器,采集方式,保存运输,不合格样本：,脂血、溶血、样本量不足,样本,分析中,分析前,设备状态,仪器：,日维护,开机自检,准备,试剂配制,核酸扩增,结果分析,结果记录,核酸纯化,检测系统,试剂,设备,质控品,人员操作,核酸检测,结果不准确,问题出在哪？,试剂耗材的质检,标本的采集与储存,仪器设备清洁维护（仪器设备状态）,人员操作,-,试剂准备,人员操作,-,样本的制备-核酸纯化,人员操作,-,加样,设备状态,-,扩增、检测,结果分析,报告解释,污染控制,标本的采集与储存,1.,采集的容器,例如：血液样本，采血管规格，抗凝剂种类？,容器到达实验室时应处于未曾开启状态,2,样本的保存,检测前、检测后,保存容器？,纯化后,DNA,的保存,避免反复冻融,仪器设备状态,1.,仪器设备校准,加样器 方式：计量部门、厂家、自校准,扩增仪 方式：厂家,温浴设备、温湿度计,2.,设备状态,清洁维护,试剂的配制,保证反应的均一性，每次试验的扩增反应混和,液应一次配出，并至少多配,1,人份。

配制时注意：试剂充分复融、混匀，开盖前瞬时离心；,配制后充分混匀，但不可剧烈震荡，分装前瞬时离心配制后不宜放置过久，因为,PCR/RT-PCR,反应液中的酶、引物、底物在低温与室温下均可按较低的效率起反应而消耗部分原料产生非特异的引物二聚体等，造成扩增效率降低，一般的建议是配制完,PCR,反应液后的,0.53,小时内应及时上机扩增，加模板后应尽快上机,试剂准备、加样,试剂配制的均一性、分装的均一性,常用试剂的分装、储存及使用容器,加样准确性和重复性,加样量,样本的制备-核酸纯化,核酸提取方法,人员操作,仪器设备状态,样本量,样本的制备-核酸纯化,一般原理：均使用去垢剂(如,Triton-100),裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶,K),消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来一般步骤：去垢剂裂解-蛋白酶处理-,有机溶剂提取-乙醇沉淀等步骤纯化目的：核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除1.核酸提取方法,样本的制备-核酸纯化,纯化质量评价：,抑制物的去除,来自样本-,血红素及其代谢产物、痰中酸性多糖和糖蛋白成份,、,降解靶核酸的核酸,酶等,来自提取过程-,乙二胺四乙酸(,EDTA)、,去垢剂如十二烷基硫酸盐(,SDS),和,chaotrope,试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂。

保证措施：,对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施；核酸提取及扩增有效性的质控,样本的制备-核酸纯化,2.人员操作,加样的准确,避免交叉污染,振荡的幅度、时间,温育的温度、时间,样本的制备-核酸纯化,3.仪器设备状态,离心机,金属浴/水浴,加样器,全自动样本处理系统,样本的制备-核酸纯化,1,纯化的原则,防止和抑制,DNase,对,DNA,的降解；,尽量减少对溶液中,DNA,的机械剪切破坏，保持,DNA,分子的完整；,将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净2,可能出现的问题,模板中含有杂蛋白质，特别是染色体中的组蛋白,模板中含有,Taq,酶抑制剂；,在提取制备模板时丢失过多，提取效率低,提出过程中引入的有机溶剂未去除样本的制备-核酸纯化,4.样本量,50,l,样本,灵敏度500,IU/ml,200,l,样本,灵敏度50,IU/ml,?,扩增、检测,1,加模板（上样）,加入提取好的核酸模板时需格外小心，往往,PCR,扩增所需加入的模板量只有,2l,，加样器的使用显得尤其重要，须控制加样精密度于准确的扩增管盖子要盖紧，,管盖没有盖好造成,PCR,反应液热蒸发，影响反应温度的准确控制及反应也各成份的浓度，同时也成为一个污染源。

压盖时由于粗心或者用力不均致使部分盖子变形，也是实验室常见的问题）,扩增、检测,熟悉仪器设备的特点，标本的放置，参数设置,扩增、检测,影响因素：引物、探针、仪器设备状态,扩增效率：,关于污染,1,样本的污染,微生物、操作人员、标本之间的交叉污染,2,扩增产物或模板的污染,试剂、加样器、操作台面,PCR,产物拷贝量大,(,一般为,10,13,拷贝,/ml),，所以极微量的,PCR,产物 污染,，,就可造成假阳就可形成假阳性气溶胶,：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含,48000,拷贝关于污染,1,样本的污染,微生物、操作人员、标本之间的交叉污染,2,扩增产物或模板的污染,试剂、加样器、操作台面,PCR,产物拷贝量大,(,一般为,10,13,拷贝,/ml),，所以极微量的,PCR,产物 污染,，,就可造成假阳就可形成假阳性气溶胶,：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染，据计算一个气溶胶颗粒可含,48000,拷贝。

关于污染,3.,污染的监测,-,阴性对照,每次,PCR,实验务必做阴性对照，它包括：,阴性,标本对照,空白试剂对照,关于污染,4,防止污染的方法,实验室合理分区,制定工作流程并严格执行,实验室的清洁,使用哪种消毒（去污染）剂？,设备、加样器、工作台面,.,选择盐酸还是次氯酸？,去污染效果取决于有效氯的浓度：,0.05 0.5%,关于污染,5,何时、怎样去污染？,喷洒,10%bleach 15-30min,清水擦,每次,PCR,后和泄漏时进行,关于污染,含氯消毒液的,稀释和贮存：,用洁净的水稀释消毒液，自来水虽然方便，但是次氯酸不稳定，尤其是在水质较硬的情况下；,尽量新鲜配置，,1,：,10,稀释的消毒液，,1-2,周稳定；,稀释的含氯消毒液放在室温不透明的容器里；将稀释的次氯酸消毒液放在常规使用的喷雾瓶中，放在水槽下温度、光照和氧化作用都可以使之分解变质关于污染,紫外,灯的使用,紫外波长（,nm,）一般选择,254/300nm,照射,30min,即可,有效距离,：,60-90cm,需要注意的是，选择,UV,作为消除残留,PCR,产物污染时，要考虑,PCR,产物的长度与产物序列中碱基的分布，,UV,照射仅对,500bp,以上长片段有效，对短片段效果不大。

其他细节问题,加样器,吸样,器,污染是一个值得注意的问题由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染其他细节问题,预混和分装,PCR,试剂,PCR,试剂都应小量分装，避免污染机会PCR,反应液应与阳性对照、样品及,PCR,产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱其他细节问题,选择质量好的,Eppendorf,管,以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部开管动作要轻，以防管内液体溅出其他细节问题,标本的长期保存,尽量用带乳胶垫环的罗口管，保证密闭谢谢！,。