实验绿色荧光蛋白(共11页).doc

精选优质文档-----倾情为你奉上 生物技术实验报告姓名：张龙龙学号：班级：11级生技02班 前言：绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的GFP 由3 个外显子组成，长2.6kb；GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60℃处理1996 年GFP 的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成. 一.实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。

二．实验原理基因工程一般包括四个步骤：一是取得符合人们要求的DNA片段，这种DNA片段被称为“目的基因”；二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA；三是把重组DNA引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来 本实验根据绿色荧光蛋白（GFP）的基因序列设计一对引物，用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来再利用双酶切切开表达载体pET23b和目的基因的两端接头，通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组将含GFP基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下，使GFP基因表达3. 实验材料及仪器1、实验材料：含有GFP的质粒；DNA Marker；DH5α；BL21；2、仪器：恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管四.实验内容4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定：1) 实验试剂：LB培养基；溶液Ⅰ；Tris-HCl（pH=8）；溶液Ⅱ；溶液Ⅲ；酚/氯仿抽提液；无水乙醇；电泳缓冲液；加样缓冲液；GoldView核酸染色剂；1%的琼脂糖凝胶；XhoⅠ(10U/μl)；NdeⅠ（10U/μl）；T4 DNA lisase。

2) 实验步骤： 质粒的提取与鉴定（1）在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落，接种于20ml含有100μl /ml Apm的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜2）分装菌液到1.5ml离心管中，冰浴2min4℃、12000rpm离心5min，收集菌体，弃上清再用同样方法收集一次菌体3）将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，涡旋剧烈振荡 ，混匀，冰浴10min4）加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管5次，充分混匀，冰浴5min5）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，轻柔快速颠倒离心管数次，使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10min4℃、12000rpm 离心10min （6）加等体积的酚/氯仿（1：1），震荡混合有机相和水相，冰浴3min4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中7）加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），振荡混合有机相和水相，4℃、12000rpm 离心10min，吸取上层水相转移到另一新离心管中8）加入2倍体积预冷的无水乙醇，-20℃沉淀DNA 10-20min。

4℃、12000rpm 离心10min，弃上清，留沉淀（管底有少量白色沉淀）9）分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀， 12000rpm 离心5min，抽吸去除所有上清，放置室温干燥，让酒精挥发10）加30μl TE（内含浓度50μg/ml的RNase A）溶解DNA，37℃放置30min，消化RNA20℃保存备用11）制1%的琼脂糖凝胶：加25mlTAE缓冲液于三角瓶称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中，与微波炉加热至完全溶化冷却至60℃左右，加1μl的GoldView溶液，摇匀轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30min以上轻轻拔掉梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm12）点样：取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样，80—100v约电泳20—30min 质粒DNA的酶切（1）酶切：按如下双酶切体系（20μl）混合反应物ⅠⅡ质粒5μl3μlXhoⅠ(10U/μl)0.5μl0.5μlNdeⅠ（10U/μl）0.5μl0.5μl10buffer2μl2μlddH2O12μl14μl 先加水，再加buffer，加质粒，加内切酶，放离心机上混匀。

在37℃水浴4h2）电泳，在紫外观察分析仪上观察酶切结果 4.2目的基因的获得和重组载体的构建1) 实验试剂：模板DNA；dNTP；Taq DNA聚合酶；引物；10buffer（内含Mg2+）；ddH2O；10T4DNA连接酶buffer；T4DNA连接酶2) 实验步骤： 目的基因的获得、检测及回收（1）依次混匀下列试剂：反应体系ddH2O9.5 μlMix12.5 μl上游引物1 μl下游引物1 μl模板1 μl混合后瞬时离心2）PCR反应程序 94℃ 预变性 3 min 94℃ 变性 30 sec 52℃ 退火 30 sec 30个循环 72℃ 延伸 1 min 72℃ 延伸 1 min 4℃ （3）电泳：扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度4）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，称取重量5）以0.1g 凝胶对应300μl 的体积加入PN6）50℃ 水浴10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解7）将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管中，13000rpm 离心60s，弃掉废液。

8）加入800μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液9）加入500μl漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液10）将离心吸附柱放回收集管，13000rpm离心2min11）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μl，洗脱缓冲液在65℃水浴中预热，室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中，13000rpm离心1min12）电泳检测回收产物，余置于-20℃保存 重组质粒的连接 将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接反应体系（μl）如下； 体系成分 体积（μl） 溶液Ⅰ 5PGM-T载体 0.2目的基因产物 4.8 将反应液混合，16℃ 30 min 4.3感受态细胞的制备及转化1) 实验试剂:LB培养液；0.1mol/L CaCl2溶液；E.coli DH5α受体菌（R-M-）；LB培养基；氨苄青霉素；IPTG；X-gal。

2) 实验步骤 感受态细胞的制备（1）活化E.coli DH5α菌株：将实验室保存的E.coli DH5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡继续培养至OD400值为0.3-0.5左右3）在已灭菌的10ml离心管总吸取上述培养液10ml，冰浴20min 后，4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清4）加2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液，重悬菌体，冰浴10min4℃、6000rpm离心10min，收集菌丝，弃上清5）将每一份沉淀轻缓的悬于0.4ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液中，轻轻重悬菌体沉淀冰上放置10min6）分装100μl/管（冰浴分装），置-4℃冰箱保存 连接产物转化感受态细胞（1）转化用固体LB培养基平板的制备 向含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG 16μl和20mg/ml的X-gal 40μl，用灭菌涂布棒涂布均匀，37℃避光倒置3 h，让溶解X-gal的二甲基酰胺尽量挥发干净。

加入IPTG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解2）连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞 ①去5μl连接产物加到100μl E.coli DH5α感受态细胞（从-70℃冰箱取出放于冰上，带钢解冻加入连接产物）中，轻弹混匀，冰浴20min②取出离心管，42℃水浴热击90s，立即置冰浴中冷却3min③向离心管中加入900μl 37℃预热的无抗生素的LB液体培养基，混匀后，37℃、200rpm振荡培养1 h，复苏菌体④取出离心管，6000rpm离心2min，弃上清800μl，用剩余的月100μl上清液将沉淀菌体吹打混匀后，加到含100μl/ml氨苄青霉素（Amp）的IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，用无菌涂布棒轻轻涂布均匀放在室温直至液体吸收倒置平板，37℃恒温培养14-16h，直至长出单菌落 4.4重组子的筛选鉴定1) 实验试剂：dNTP；Taq聚合酶；引物；10buffer（内含Mg2+） ；ddH2O ；NdeⅠ；XhoⅠ；Apm；LB培养基2) 实验步骤 重组质粒的PCR鉴定（1）挑取单菌落：使用无菌枪头挑取5个白色单菌落，放入内含有氨苄抗生素的LB液体培养基的1.5ml离心管中，振荡培养4h以上，吸取0.5μl菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。

2）PCR反应体系（10μl）ddH2O9.5 μlMix12.5 μl上游引物1 μl下游引物1 μl模板1 μl 混匀后瞬时离心3）PCR反应程序 94℃ 预变性 3 min 94℃ 变性 30 sec 52℃ 退火 30 sec 30个循环 72℃ 延伸 1 min 72℃ 延伸 1 min 4℃ （4）电泳： 扩增产物用1%琼脂糖凝胶进。