分子生物学实验课：RNA2015.ppt

TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNA•RNA:一个典型的哺乳动物细胞中的总RNA各类组分占比•    •      核糖体RNA（rRNA）     80%--85%    主要有 28s、18s 、5.8s、 5s•     转运RNA和小核RNA      15%--20%•    •    信使RNA(mRNA)            1%--5%TRIZOL法提取总RNA简介•研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA•RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败•Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA 的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎核酸由于核蛋白二级结构的破坏而解离下来异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA 的完整性在酚和氯仿作用下离心，样品分成水样层和有机层RNA存在于水样层中收集上面的的水样层后，用异丙醇沉淀RNARNase处理•所有玻璃器皿均应于使用前180℃干烤3h或更长时间，塑料器皿可用0.1％DEPC浸泡或用氯仿洗涤经过DEPC水处理的器皿容器等，最后高温高压灭菌15分钟，以去除残留的DEPC。

DEPC水有致癌性，操作时要小心•全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套•配制的溶液应尽可能用0.1％DEPC在37℃处理12h以上，然后高压灭菌除去残留的DEPC不能高压灭菌的试剂，用经DEPC处理过的无菌蒸馏水配制，然后用0.22um滤膜过滤除菌   步骤• 解剖大鼠肝脏，每个样品取50-100mg组织，立即加入1mlTRIZOL试剂•移入1.5ml Ep管中，室温静置5min• 每1ml TRIZOL中加氯仿0.2ml，振荡器摇振15s，置室温2～3min• 4℃离心，12,000g×15min• 仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中• 加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min• 4℃离心，12,000g×10min•弃上清，加75％乙醇1ml，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min• 弃上清，空气干燥5-10min，加入50μl无RNase水重悬沉淀•核酸定量或电泳检测多余样品-70℃保存备用注意事项注意事项•抽提及操作RNA中要谨防RNase的污染，因此操作RNA的试剂及器皿都要进行相应的处理•全部实验过程最好戴一次性手套，接触可能污染了RNA酶的物品后，应更换手套 •样品量和Trizol 的加入量一定要按比例，不能随意增加样品量或减少Trizol 量，否则会使内源性RNase 的抑制不完全，导致RNA 降解。

 电泳检测•琼脂糖凝胶电泳是检测和分离核酸的常用方法•琼脂糖琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖浓度•RNA/DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动•琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系因而就可依据DNA分子的大小使其分离该过程可以通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测•溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比据此可粗略估计样品DNA浓度检查制备的RNA的质量•经凝胶电泳后，28s rRNA和18s rRNA应当能清楚地在紫外灯下看到也应当能看到一条由tRNA，5.8s、5s rRNA组成的，较为模糊迁移较快的带若RNA没有降解，28s的亮度应当是18s亮度的2倍，且这两条带无弥散现象加样孔附近有条带表面有DNA存在mRNA是不可见的，除非过量上样注意事项•EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境•实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样。

制备琼脂糖凝胶实验步骤（1） 0.25g 琼脂糖加入25ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解2）冷却到60℃，加入1μl的0.5mg/ml EB，并摇匀3）将将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固4）将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子5）用移液器吸取总RNA样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6Xloading buffer，混匀后，小心加入点样孔6) 打开电源开关，调节电压至120V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min 上样上样预染色的标本预染色的标本预染色的标本预染色的标本电泳检测结果：电泳检测结果： RNA提取：提取： 关键关键 防止防止RNARNA降解降解RNA提取的成功与否提取的成功与否是是RT-PCR检测中最检测中最重要的步骤重要的步骤核酸定量•组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276 nm，胸腺嘧啶：264.5 nm，尿嘧啶：259 nm。

这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础 • 在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml   DNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数× 50/1000（ug/ul）    RNA样品的浓度为：OD260×核酸稀释倍数 ×40/1000（ug/ul）       •故根据OD 260 /OD 280的比值可以估计核酸的纯度：         DNA样品的比值为1.8， RNA样品的比值为2.0若DNA样品的比值高于1.8，说明样品中含有RNA污染， 若RNA样品比值高于2.0，则提示RNA 有降解RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导致比值降低定量实验步骤•取适当体积（2ul）核酸样品，加水或（TE）至100ul，混匀•将核酸定量仪调制RNA测定一项，输入稀释倍数，然后把样品放入核酸定量仪中读数核酸定量仪将直接给出样品浓度 RT逆转录（reverse transcription，RT）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。

此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录 RNA、、缓冲液、缓冲液、dNTP、、逆转录酶、逆转录酶、引物（随机引物引物（随机引物/Oligo dT)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNA1.逆转录：逆转录：RT 体系配置RT反应程序在PCR仪上设置RT反应程序，上机运行。