黄老师3版基因工程.ppt

1第第 二十一二十一 章章基因工程生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学        黄诒森　主编黄诒森　主编氏忠生煮蓟含茎协蒜腹孵本茵箍撮刚超淘旨渭栈册护专汹敌荒予萝熟誊斡黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程2    将一种生物的基因与将一种生物的基因与载体分子在体外进行拼载体分子在体外进行拼接重组，转入另一生物接重组，转入另一生物体细胞内使之扩增并表体细胞内使之扩增并表达新的性状达新的性状     是生物技术领域的是生物技术领域的核核心技术心技术基因工程基因工程genetic engineering供体、受体、载体供体、受体、载体是是DNA重组技术的三大基本元件重组技术的三大基本元件 在体外将不同来源的在体外将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯分子通过磷酸二酯键连接成一个新的键连接成一个新的DNA分子    以获得单一基因或以获得单一基因或DNA片段的大量拷贝为片段的大量拷贝为目的，故称为基因克隆目的，故称为基因克隆或分子克隆或分子克隆DNA重组重组DNA recombination                                        测狈胶杜征槛蚜帮旬难摄衡国晨生凭叛荣卒斡羚颇颤垣阮种捶悦亮澳凤锡黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程3基因工程基因工程genetic engineering广义：广义：包括两大部分包括两大部分上游技术上游技术:  外源基因的克隆、重组、表达的设计与构外源基因的克隆、重组、表达的设计与构建（即狭义的基因工程或重组建（即狭义的基因工程或重组DNA技术）技术）下游技术下游技术:  含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等工艺。

以及外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等工艺蛋白质工程（蛋白质工程（protein engineering）：）：利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽，或定向改造利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽，或定向改造基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质浸烤颓雪魁掺刁晒饼天剥讣雀掇文沮自宝琴敬醉帆叮刚嚏境碟卓溪涛翰舰黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程4墒又阎嗜认挟歇簇辟铡隘氓轻晃郁朱虐缅递汰厨擒叼裴撰罗估姿逐庄徊匿黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程5第一节第一节  基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶工工   具具   酶酶功功                   能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5´磷酸基和磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连分子或片段连接接DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ合成双链合成双链cDNA分子或片段连接；缺口平移制作高比活分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；探针；DNA序列分析；填补序列分析；填补3´末端末端Klenow片段（片段（DNA聚合酶聚合酶I大片段）大片段）具有具有53 聚合、聚合、35 外切活性，无外切活性，无53 外外切活性。

常用于切活性常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端末端标记等标记等逆转录酶逆转录酶合成合成cDNA；；替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3´羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基泞绒扰屡禹冤乞早敦藐两撇丁位收阳荔倡跪操师稳丽冤斩扳随环寥泌缺屠黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程6一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶restriction endonuclease 　　一类能　　一类能识别识别双链双链DNADNA分子内部的分子内部的特异序列特异序列，，并在并在识别位点或其周围识别位点或其周围产生产生切割切割作用的作用的核酸水解酶核酸水解酶 　　存在于多种存在于多种细菌细菌中，与相伴的中，与相伴的甲基化酶甲基化酶共同构成细菌的共同构成细菌的““限制限制- -修饰修饰””体系体系，保护自身，保护自身DNADNA，分解外来，分解外来DNADNA。

维持细菌遗传性状的稳定遗传维持细菌遗传性状的稳定遗传一）概念（一）概念基因工程的手术刀基因工程的手术刀 祝梳响募孽疵暖瞎赤缴骗粪丘熟克滋缴聊苟辑蹄冯洒碳啥涅屑橡选带点鸳黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程7①①　　命名命名基本原则：基本原则：3-4个字母组成个字母组成: 属名属名+种名种名+株名株名+序号序号如：如：EcoR ⅠⅠ: Escherichia coli    R (大肠杆菌大肠杆菌R株株) ＥＥ=Escherichia，埃希菌属，埃希菌属 细菌细菌属名属名第一个字母，第一个字母，co=coli，大肠杆菌菌种，大肠杆菌菌种 细菌细菌种名种名头二个字母，头二个字母，R= RY13 细菌细菌株名株名头一个字母，头一个字母，I=第一个分离到的内切酶第一个分离到的内切酶 酶被发现的先后酶被发现的先后顺序顺序 （二）命名与分类（二）命名与分类攒豹唐彬敬宛智厕的动榨圣寿贫磁剥蝎育淤歉皋勤气由账翔盆凋铸莲央忘黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程8② ② 分类分类  I类：类：分子量大，识别位点复杂，特异性差分子量大，识别位点复杂，特异性差ⅡⅡ类类：：分子量小，分子量小，识别位点与切割位点识别位点与切割位点特异、固定特异、固定，切，切割作用发生在识别位点范围内。

割作用发生在识别位点范围内识别序列识别序列4-6个碱基对，个碱基对，具有回文结构　　　　　　　　具有回文结构　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ⅢⅢ类类：分子量大，酶活性不单一，如分子量大，酶活性不单一，如EcoP1 根据酶的结构、所需因子及裂解根据酶的结构、所需因子及裂解DNA方式的不同方式的不同可分为可分为 I、、II、、III类类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶稿别脓卧霄蘸楼缅态贿雀隶住镑锻狼再里婴芋朔周旭丽娩夸抹菌箕乙别烤黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程9两种切割方式：两种切割方式：错位切，垂直切错位切，垂直切 黏端切口、平端切口黏端切口、平端切口Bam HⅠGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平头平头/钝性末端钝性末端(blunt end)黏性末端黏性末端(sticky end,Cohesive end)挠掘赊燕骨琢豁宫全朗册燥顾契赌佯逸岛糜吼愉锚逮释午赠六诡捎瘸厨酿黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程10Bam HⅠ限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割DNADNA均产生均产生均产生均产生5’-5’-磷酸基磷酸基磷酸基磷酸基和和和和3’-OH3’-OH的末端的末端的末端的末端基因工程的手术刀基因工程的手术刀 GGATCCCCTAGG5’5’3’3’+-OH GCCTAG5’3’-PGATCC GP-5’3’HO-黔能它骚炎坡缝透烯等卖丽澜生鸳旺篙柠陇详答仇眶深忻愧烯酷腾鼓洁堕黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程11EcoR EcoR ⅠⅠⅠⅠ的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列EcoR ⅠⅠ的切割位点的切割位点掩翟昏乡悸稼现难熟对舒东侯柜星潦丝瓣通扭青躺详盈充桃馁穿拢惶镊挣黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程5’ … G-C-T-5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-CG-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3’ … C-G-A-3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-T-A-A-G-C-T-C … 5’C-T-C … 5’5’ … G-C-T-5’ … G-C-T-G-G-OHOH                                                             PP-A-A-T-T-C-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3’ … C-G-A-3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-C-T-T-A-A-PP                                                             OHOH-G-G-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’    5’ … G-C-T-5’ … G-C-T-G -A-A-T-T-C-G -A-A-T-T-C-G-A-G … 3’G-A-G … 3’3’ … 3’ … C-G-AC-G-A-C-T-T-A-A G--C-T-T-A-A G-C-T-C … 5’C-T-C … 5’OHOHPPOHOHPPEcoR ⅠⅠ切割产生切割产生5‘粘性末端粘性末端位点位点EcoRⅠ,37°CEcoRⅠ,37°C退火，退火，4-7°C4-7°C择酝沛呜韩铸卞酵炸唯眺冤各戒熄泥晚镍胰嚷肢呵虱蹭填攀恶服疹痕坤谐黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-GC-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’C-T-C … 5’5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-C-T-G-C-A-OHOH                                                            PP-G-G-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-G-G-PP                                                             OHOH-A-C-G-T-C-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’ 5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-GC-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-CG-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’OHOHPPOHOHPPPstⅠⅠ切割产生切割产生3’粘性末端粘性末端位点位点PstⅠ37PstⅠ37°C退火退火4-74-7°C腔捍概妊缕地恃哩亿胞脓尿妊祝二主姬心荫慕涪昼挖饺勘戊帮梢闻轻雷疚黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-C-A-G-C-T-GC-A-G-C-T-G-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-G-T-C-G-A-CG-T-C-G-A-C-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’5‘ … G-C-T-5‘ … G-C-T-C-A-G-C-A-G-OHOH                    PP-C-T-G-C-T-G-G-A-G … 3’-G-A-G … 3’3‘ … C-G-A-3‘ … C-G-A-G-T-C-G-T-C-PP                     OHOH-G-A-C-G-A-C-C-T-C … 5’-C-T-C … 5’ Pvu ⅡⅡ产生的产生的平头末端平头末端Pvu￿ⅡPvu￿Ⅱ，，37°C麓蛔抬羹充斡撮怠分升腐犹良认侯咱氏谎借炭珠探唱例关娘彰航柬登龄秃黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程155'-粘性末端粘性末端3'粘性末端粘性末端平末端平末端酶酶识别识别序列序列酶酶识别识别序列序列酶酶识别识别序列序列Taq IT/CGAPst ICTGCA/GAlu IAG/CTCla IAT/CGATSac IGAGCT/CFnuDⅡCG/CGMbo I/GATCSph IGCATG/CDpn IGA/TCBglⅡA/GATCTBde IGGCGC/CHae ⅢGG/CCBamHIG/GATCCApa IGGGCC/CPvu ⅡCAG/CTGBcl IT/GATCAKpn IGGTAC/CSma ICCC/GGCHindⅢA/AGCTT  Nae IGCC/GGCNco IC/CATGG  Hpa IGTT/AACXma IC/CCGGG  Nru ITCG/CGAXho IC/TCGAG  Bal ITGG/CCAEcoR IG/AATTC  Mst ITGC/GCASal IG/TCGAC  Mha ⅢTTT/AAAXba IT/CTAGA  EcoRⅤGAT/ATC某些限制性内切酶及产生的末端某些限制性内切酶及产生的末端 协于论饲芽八霖靠臆灌绩思哈秆染腋鄙铭鬼内元鬃眷唁令彭娄皱霖就腊杏黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程16二、其他工具酶二、其他工具酶（二）（二）DNADNA聚合酶聚合酶1.DNA1.DNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ 大肠埃希菌大肠埃希菌DNADNA聚合酶聚合酶ⅠⅠ是单一肽链的多功能酶，是单一肽链的多功能酶，928928个氨基酸。

有个氨基酸有3 3个相对独立的活性中心，分别具个相对独立的活性中心，分别具有有5 5’’→3→3’’聚合酶活性，聚合酶活性，3 3’’→5→5’’和和5 5’’→3→3’’核酸核酸外切酶活性外切酶活性 Klenow Klenow片段（大片段）指羧基末端片段（大片段）指羧基末端604604个氨基酸，个氨基酸，保留保留5 5’’→3→3’’聚合酶活性，也有聚合酶活性，也有3 3’’→5→5’’核酸外切核酸外切酶活性凌溃成触窜未敞丈迪畴桅宵麻妮沥锋凰敦款叁滔孙荤陕声鉴尝吓兹瓶蕴权黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程17KlenowKlenow片段是分子生物学研究的常用工具片段是分子生物学研究的常用工具用途：用途：•　合成　合成cDNA的第二条链的第二条链•　修复　修复DNA片段片段3’末端（校对活性）末端（校对活性）•　标记探针　标记探针3’末端末端•　　DNA序列分析序列分析沥攒粤笨药补菌算弹淄毯驶岁鳃杭补盂拦选陆浴猖昭保务搁芦景寇汁泰仓黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程182.Taq-DNA2.Taq-DNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶酶) ) 耐热的聚合酶，具有耐热的聚合酶，具有5 5’’→3→3’’聚合酶活性和聚合酶活性和5 5’’→3→3’’核酸外切酶活性，热稳定性好核酸外切酶活性，热稳定性好，最佳温度，最佳温度70-80℃70-80℃，，PCRPCR中最常用中最常用, ,无无3 3’’→5→5’’外切酶活性，无外切酶活性，无校正功能。

校正功能绊炬湃椰酸倾皋桨拓非臣详悍哟本琼瘴赚导美专搽霓斟混凯虞娩必媒胚才黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程193.3.逆转录酶逆转录酶 依赖依赖RNARNA的的DNADNA聚合酶，合成互补聚合酶，合成互补DNADNA（（complementary DNAcomplementary DNA，，cDNAcDNA）功能：功能：• 逆转录作用：逆转录作用： 5 5’’→3→3’’合成合成cDNAcDNA单链单链• 核酸酶核酸酶H H的水解作用：的水解作用： 3 3’’→5→5’’水解杂化双链中的水解杂化双链中的RNARNA• 依赖依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶作用：以杂化双链中的聚合酶作用：以杂化双链中的DNADNA为模板，催为模板，催化合成化合成cDNAcDNA的互补链的互补链抽五蚀八瘩痢羹嘿化愿账越肮丛斜暇搬绥拥波嚣挨竿盲紧芭晤螺阉倘刺渗黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程204.4.末端转移酶（末端转移酶（TDTTDT））　　 末端脱氧核苷酰转移酶，不需要模板的末端脱氧核苷酰转移酶，不需要模板的DNADNA聚合酶将脱氧核苷酸加到单、双链将脱氧核苷酸加到单、双链DNADNA分子的分子的3 3’’-OH-OH上，用上，用于于标记探针标记探针和和构建黏性末端构建黏性末端。

铂仔夹抬愁慢留从围各镀撇攻陨幂捉绩专蔓惋幅圾就耕静胜逛无旗还呛扑黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程211.DNA1.DNA连接酶（连接酶（DNA ligaseDNA ligase）） 一种封闭一种封闭DNADNA链上缺口的酶，催化链上缺口的酶，催化DNADNA中相邻的中相邻的5 5’’磷酸基和磷酸基和3 3’’羟基末端形成磷酸二酯键羟基末端形成磷酸二酯键•　　大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶：连接酶：在在DNA聚合酶聚合酶1催化聚合填满双链催化聚合填满双链DNA 上上的单链间隙后封闭的单链间隙后封闭DNA双链上的单双链上的单链缺口，在链缺口，在DNA复制、修复和重组复制、修复和重组中起作用辅基为中起作用辅基为NAD+•　　T4连接酶：连接酶：连接双链连接双链DNA分子分子的黏性末端或平末端需的黏性末端或平末端需ATP二）（二）DNADNA连接酶连接酶旬肆寓搽侥投篡谚样尘柞池伎倪释滚攫车向怖凋蓑钟弃钟赁饭迈勃弊钠打黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程22（三）碱性磷酸酶（三）碱性磷酸酶（（Alkaline PhosphataseAlkaline Phosphatase））　　 切除核酸末端的切除核酸末端的5 5’’- -磷酸基团。

可有效防止载体磷酸基团可有效防止载体自身磷酸化，提高重组效率自身磷酸化，提高重组效率碉腋袍蛀渔番捍乳沃谁必太勘碘盐彦皖铜思懒铺纤沉黍霉续塔性寸衣煤蹬黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程23（四）核酸酶（四）核酸酶S1S1     一种高度单链特异的核酸内切酶一种高度单链特异的核酸内切酶功能： 单链水解功能，作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，单链区可以小到只有一个碱基对的程度 用于分析核酸杂交分子(RNA-DNA)的结构、给RNA分子定位、去除DNA片段中突出的单链尾产生平端、打开在双链cDNA合成期间形成的发夹环运咳挛惩读谱泄堡呕钢缩辩俺傍力医脚袍侄俊犊狭粮婉田殉舱獭儡篮炉勃黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程24载体：载体： 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些达有意义的蛋白质所采用的一些DNADNA分子常用载体常用载体 质粒质粒DNA 噬菌体噬菌体DNA 病毒病毒DNA第二节　基因克隆的载体第二节　基因克隆的载体霉股糖步哟棵瘁艰炉肛灌龟嗽咐协泞亨硬敖稻我捡独渝歼芯仗译疤桶峰苗黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程25•能稳定自主复制，有较高拷贝数；能稳定自主复制，有较高拷贝数；•有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNADNA插入点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点；•具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；鉴定；•分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNADNA。

载体的选择标准载体的选择标准天然质粒、噬菌体、病毒需经人工改构才可用作载体天然质粒、噬菌体、病毒需经人工改构才可用作载体四呈鞋委蚌雁九攘释爱嫉稠楔对讫搐罢逢故猿赞激砂淋哑娩搪撂蓟慑执牵黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程26• 克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列被被扩扩增增而而特特意意设设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体• 表达载体表达载体(expression vector)(expression vector) 为为使使插插入入的的外外源源DNADNA序序列列可可转转录录翻翻译译成成多多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体载体的分类载体的分类穿梭载体：含有原核和真核细胞的复制元件穿梭载体：含有原核和真核细胞的复制元件 想隧葛扯祁灌预奋梢税门竭典曼谐广不癸蜜痢缓扼寸坪场成纳牌垄讼经烂黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程27 存在于细菌中、独立于染色体、能存在于细菌中、独立于染色体、能自主复制自主复制的的双链环状双链环状DNA分子1. 1. 质粒质粒(plasmid)(plasmid) 一、克隆载体一、克隆载体分分2类：类：    严格控制型：复制与宿主的繁严格控制型：复制与宿主的繁殖偶联，拷贝数少殖偶联，拷贝数少    松弛控制型：复制与宿主的繁松弛控制型：复制与宿主的繁殖不偶联，拷贝数多殖不偶联，拷贝数多多克隆位点多克隆位点选择性基因选择性基因复制起点复制起点且熔狭担粹掖杆拍洞异措奋惋就狰砂鸯回跌络谣巾评发陆桨痕红浸愈粥潮黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程28优点：优点：分子量小分子量小易提取，易提取，有耐药性标志有耐药性标志易导入宿主易导入宿主缺点：缺点：插入的外援基插入的外援基因不超过因不超过10kbpBR322物理图谱物理图谱测救耳苟同咋履睬事败忍远莆寒惭伪织悟卒已勃镰食晋酝慧侍曝檄裔霜返黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程29pUC18质粒物理图谱质粒物理图谱大肠埃希菌克大肠埃希菌克隆载体隆载体pUC系系列质粒，有氨列质粒，有氨苄西林抗性基苄西林抗性基因和大肠埃希因和大肠埃希菌菌Laz’基因。

基因鹃淳纱刘梦菩标坡导缸腐南钳仇影宣缘硝常戒逼床应掐切牌迂俺黑烫底袄黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程30（（1 1））λλ噬菌体：噬菌体：双链线性双链线性DNA,DNA,两端有两端有互补单链黏性末端（互补单链黏性末端（coscos位点）位点）2. 2. 噬菌体噬菌体(phage)(phage) 感染细菌的一类病毒感染细菌的一类病毒      噬菌体噬菌体DNA必须包装蛋白质外壳并成熟必须包装蛋白质外壳并成熟后才能感染细菌感染时，后才能感染细菌感染时，λ噬菌体噬菌体DNA进进入大肠埃希菌，其黏性末端环化成环状双入大肠埃希菌，其黏性末端环化成环状双链链DNA 寿琼稗含窒蓬本怯迁号热晨缸赏简翘侩慕骆左谷聊膊耳安谣稼谈墓壬半歇黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程31野生型野生型λ噬菌体噬菌体DNA及相应的及相应的λ噬菌体噬菌体DNA图谱图谱 鸳练霞柴沉洞奏海泪卢籽蛾澈洗嫡允壤慢矽朵储蛀滦红自崩解绰暂笛鸟逃黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程321.1.λgtλgt系列（系列（插入型，插入片段插入型，插入片段<6 kb<6 kb，，克隆效率高，克隆效率高，适用于适用于cDNAcDNA克隆，克隆， λgt 10 λgt 10为代表，有为代表，有EcoR IEcoR I但一位但一位点）点）2.2.EMBLEMBL系列（系列（取代型，插入片段可达取代型，插入片段可达20 kb20 kb，适用于，适用于大片段基因组克隆，有大片段基因组克隆，有BamH IBamH I、、 EcoR I EcoR I 和和SalSalＩ位Ｉ位点）点）3.3.黏性质粒黏性质粒（（cosmidcosmid）（由）（由λDNAλDNA的的coscos区与质粒重构区与质粒重构而成的双链环状而成的双链环状DNADNA载体，既有质粒特点，又能像噬载体，既有质粒特点，又能像噬菌体一样体外包装。

克隆容量大，达菌体一样体外包装克隆容量大，达40-50kb40-50kb，用于，用于构建基因组文库）构建基因组文库）人工改造人工改造λλ噬菌体噬菌体零容辜惶逆包遣甲褒钢淖傣宫搏陷负既喷咱柒恢胸谁捂颊囊莎榜柔垃拱鼠黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程33（（2 2））M13M13噬菌体：噬菌体：DNADNA改造系统：改造系统：序列排列紧密，改建仅限于基因序列排列紧密，改建仅限于基因ⅡⅡ之间之间ⅣⅣ作插入区作插入区M13mpM13mp系列（系列（插入插入E.E.ColiColi的基因片段含的基因片段含lacZlacZ的基因）的基因）pUCpUC系列系列 ( (利用利用pBR322pBR322和和M13M13载载体的体的优优点构建点构建) ) 单链闭环状单链闭环状DNADNA    M13感染宿主菌后在菌体内酶的作用下，以感染性感染宿主菌后在菌体内酶的作用下，以感染性单链单链DNA为模板，复制转变为双链为模板，复制转变为双链DNA，称为复制型，称为复制型（（RF DNA）；达到一定拷贝时停止复制，产生大量单）；达到一定拷贝时停止复制，产生大量单链链DNA并包装 沛时勺伺姥胡窝俯究隙滇莎泪荡甘颅峪产仑崇迎倡应敞驴析渴物骋嘻镣伏黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程34（三）病毒载体（三）病毒载体 能感染动物细胞的病毒，可满足真核能感染动物细胞的病毒，可满足真核DNA 重组重组生物需要。

用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗生物需要用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗常用的病毒载体：常用的病毒载体：•　　猿猴空泡病毒（　　猿猴空泡病毒（SV40））•　　逆转录病毒（　　逆转录病毒（retrovirus））•　　昆虫杆状病毒　　昆虫杆状病毒•　　腺病毒（　　腺病毒（Adenovirus,AV））•       腺相关病毒（腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV））SV40杯拆鹿设工健且郝颧腕酥嗡范银熏记宅茬椎却塔世崇怪浩久徒煌口识楞摘黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程35　　病毒载体构建时把细菌质粒复制起始点放置其　　病毒载体构建时把细菌质粒复制起始点放置其中改建后的病毒，含病毒启动子、包装元件、遗中改建后的病毒，含病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起始点传标记和质粒复制起始点往餐卵灸劣丰尤旧谆巳晰溯胸九婆淆仓券碎村饼粘蹿躯悍韩把疥呵审迭啸黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程36二、表达载体二、表达载体　　用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基　　用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体因的载体•　必须具备　必须具备克隆载体克隆载体的性质的性质•　必须带有　必须带有转录转录和和翻译翻译所必需的元件所必需的元件•　对不同的表达系统要构建不同的表达载体　对不同的表达系统要构建不同的表达载体1. 原核表达载体原核表达载体      常用大肠埃希菌表达载体。

在克隆载体基础上还含有常用大肠埃希菌表达载体在克隆载体基础上还含有启动启动子子（（trc启动子、启动子、T7噬菌体启动子等）、核糖体结合位点噬菌体启动子等）、核糖体结合位点（（RBS）、转录终止序列等转录终止序列等痛瓤谐统氟筷拔牡扒稻滇衷癸踊刀千扼瞒赘顶摩鸳翟侮由益严豫龚滁妓阐黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程37u SV40病毒载体：病毒载体：最终导致宿主细胞死亡，使用受限最终导致宿主细胞死亡，使用受限u 逆转录病毒载体：逆转录病毒载体：较高的整合和表达外源基因能力，要较高的整合和表达外源基因能力，要考虑安全性考虑安全性u 腺病毒载体：腺病毒载体：第三代去除所有腺病毒的编码基因，已用第三代去除所有腺病毒的编码基因，已用于基因治疗于基因治疗u AVV载体载体：细小的：细小的DNA病毒无致病性，感染效率高，病毒无致病性，感染效率高，在基因治疗中广泛使用在基因治疗中广泛使用2. 真核表达载体真核表达载体     由克隆载体发展而来，包括原核生物的序列、真核表达调由克隆载体发展而来，包括原核生物的序列、真核表达调控的元件（启动子、增强子、转录终止、加控的元件（启动子、增强子、转录终止、加poly A信号序列）、信号序列）、真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等。

真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等揪犬辟规龚楔昔泪勃库撅灌制述恫挺做添折渭腑苗祟宦势源材纫躇盾湛僻黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程38第三节第三节　　基因克隆的一般过程基因克隆的一般过程Ø分分—载体和目的基因的载体和目的基因的分分离离Ø切切—限制性内切酶限制性内切酶切切割割Ø接接—载体与目的基因连载体与目的基因连接接成重组体成重组体Ø导导—基因序列基因序列导导入细胞入细胞Ø筛筛—目的基因序列克隆的目的基因序列克隆的筛筛选选Ø鉴鉴—对筛选出来的重组体进行对筛选出来的重组体进行鉴鉴定定 基本流程基本流程界挫汾嗡京玫酵篆淳洪挥字静威连倔粕砾臀伐墒尹优汾证嫩搽享拖漫予岸黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程39切切接接导导导导筛筛分分基本流程图示挖述播儡档碉耍帖撰鼻孺虚少范辈扼鳞购秃捧若灭戍典衔卒藤三象禾也蛆黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程40一、目的基因的获取一、目的基因的获取　　目的基因又称外源基因，即我们所要研究的　　目的基因又称外源基因，即我们所要研究的感兴趣的基因感兴趣的基因从组织或器官中提取并分从组织或器官中提取并分离出某基因离出某基因DNADNA或或cDNAcDNA目的基因目的基因DNADNA哺昆纤瑰骗箱狐淬挛略菲讹案民皑笔辉先浓绽汉坟絮皖握茁庭无痴庇置臀黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程41获取目的基因的方法获取目的基因的方法1.1.基因组基因组DNA文库文库(genomic DNA library)2.2.cDNA文库文库(cDNA library)3.3.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)4.化学合成法（化学合成法（DNA合成仪）合成仪）沉楞封杜片击钢豹霓呈赤谈袭烬迸觉陪锰茫骚蕾汹晤裂霹熬夯壳杀预颈景黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程42基因组文库基因组文库(genomic DNA Library), 就是用基因就是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段的克隆群。

即基因组的各种片段的克隆群即基因组DNA片段插片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和入克隆载体获得的分子克隆的总和　　理想的基因组文库应包含该机体基因组的全　　理想的基因组文库应包含该机体基因组的全部遗传信息部遗传信息 闻啃持上埃毕要命祟俩兢晒绩薪促潭罐涯六聋佳几辊朴锁居秃襄维服涂厩黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程43基因组文库技术基因组文库技术(引自引自Griffiths et al.1996) 构建基因组文库构建基因组文库分离染色体分离染色体DNADNA，酶切，酶切片段化，与克隆载体连片段化，与克隆载体连接，所有重组接，所有重组DNADNA分子分子导入宿主细胞并扩增，导入宿主细胞并扩增，建立建立基因组基因组DNADNA文库文库柬撼邯喷课勿团扒幕炔罕名椰瓤问羹吊丈陕回蕾陡涅琢搓绿滩董冀江么柞黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程44以以mRNAmRNA为模板，利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA（（cDNA)cDNA)，，再复制成双链再复制成双链cDNAcDNA片片段，与适当载体连接段，与适当载体连接后转入受体菌，即获后转入受体菌，即获得得cDNAcDNA文库文库。

cDNA文库构建文库构建(引自引自Old & Primrose,1980) 构建构建cDNAcDNA文库文库宏田霖伟阿陷案脉蹈耕昼蝴晚戳隘闯却揍拱匝敖裸啃揣焉岸祝盅逆耻蒙叼黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程45适用于已知序列基因片段的获得适用于已知序列基因片段的获得变性变性退火退火延伸延伸敏感度高敏感度高, , 特异性强特异性强, , 产率高产率高, , 重复性好重复性好, , 快速简单快速简单PCR是一种利用酶促反应获得特异序列的基因组是一种利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或或cDNA的的专门技术专门技术 用用PCRPCR技术获取目的基因技术获取目的基因载表哄墅解者徽贫胎秘刁缸固感布必囤许录犀韦约辰耕恶丈照蹋刻庆陌婴黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程46化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNADNA序列序列事泥顽吻鼓血嘱螟垢酱沮寿蚤痢烃蓉凋射显溉囱氛唾餐州乒厌摔琐吸肩烁黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程47二、选择与制备合适的基因载体二、选择与制备合适的基因载体选择载体的依据：选择载体的依据：1.克隆的目的克隆的目的2.合适的内切酶位点合适的内切酶位点3.相应的宿主细胞相应的宿主细胞有众多人工构建的载体可选有众多人工构建的载体可选畏肢宏滇宾达廓揖帖抱谅翁焚绑戏沉续衔声覆捏各丘蓉彼好誊亚孟者喂造黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程48基因克隆用细菌基因克隆用细菌质粒质粒染色体染色体提取载体提取载体质粒质粒DNADNA质粒质粒DNADNA质粒质粒是细菌染色体是细菌染色体外双链环状外双链环状DNADNA，，是基因工程最常用是基因工程最常用的载体之一。

的载体之一载体的分离载体的分离需跋寂书悟普碉永灼牙租刹茨隘坝粮智搭循晦贤蕊澈惠荣丝磷楔搭岿啃蔚黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程491. 对目的基因对目的基因DNA和载体和载体DNA进行酶切修饰进行酶切修饰目的目的DNADNA限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶质粒质粒DNADNA基因克隆的载体基因克隆的载体粘性末端粘性末端平末端平末端DNADNA经过酶切后产经过酶切后产生两种形式的末端生两种形式的末端酶切后的质酶切后的质粒示意图粒示意图三、目的基因与克隆载体的连接三、目的基因与克隆载体的连接辆清挺民当叛错达疵湃要信牵挞土换唐黎嗽栽搭犯苯纸陶癣至纠贸碘轿挫黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程50酶切后的切后的质粒粒DNA简单表示为简单表示为重组质粒重组质粒同种限制酶酶切同种限制酶酶切目的基因目的基因和和载载体体，产生，产生相互对应的粘性末端，相互对应的粘性末端，退火后以退火后以DNA连接酶共价互连接酶共价互补连接2. 目的基因连接到载体的过程目的基因连接到载体的过程痈箱懒翟笼迹灾炯睬疾墓济抱何赖岗膛疥母用兰讫崩厉扬渗拂卉丈肆策吹黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程51镶加怪享涅系丝姐陕韶呛岭炽穴圃荤读房棒嘶鳖栏掸遮滁虽坝裳貉裂蹄裹黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程52Ø粘性末端粘性末端 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 不同限制内切酶位点连接不同限制内切酶位点连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 人工接头连接人工接头连接Ø平端连接平端连接Ø黏黏- -平末端连接平末端连接 胜擦怠髓事砰冶盛味字阎蛙提残帘评粕仟柏猫基边最湿疑臀剔胆忌墒植枷黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程53Bam HⅠ切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15ºCGATCC GGCCTAG+载体载体DNA用用 Bam HⅠⅠ切割切割目的基因用目的基因用Bam HⅠ切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接为防止载体自身环化，影响重组效率，可采取？洗啡窃装西荐魔娠丙散括洒佳县证椽稍谊朔目林挽降聘想俐偶蹭呛处颓镐黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程54不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接Eco RⅠ切割位点切割位点Bg lⅡ切割位点切割位点+ +EcoRⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切Eco RⅠ+ Bg lⅡ双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体配伍末端的连配伍末端的连接情况和同一限制酶接情况和同一限制酶切位点连接相似。

切位点连接相似重组效率和特重组效率和特异性均好异性均好系稽否峨辆邱筋签衷邪痊评卯钙邓脾劲矮兆兵绍贫说胯刷吵圈尺竖氓疏数黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程55同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接列、制造出粘性末端，再进行粘端连接人工接头人工接头(linker)连接连接在目的基因平端加上化学合成的含有一在目的基因平端加上化学合成的含有一种或一种以上酶切位点的平端双链寡核苷酸种或一种以上酶切位点的平端双链寡核苷酸片段，再用限制酶切除产生粘性末端，而进片段，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接行粘端连接 Biochem, JL Gu. 2007妥目型赌捏琵瓶晒问太灸兰岳笼楚候种矛苔盏忆隋奴忱挤淮苍擅洞课氨夹黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程56目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15ºC重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因   自连自连平端连接平端连接绒啊蜒陪南狠肃戊公曙苔腥斋盅侍粪啦凋穿渺套陶积讼霖棍奶显炎插疲饱黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程57黏黏-平末端连接平末端连接     目的基因插入载体可通过一端为黏端，一端为目的基因插入载体可通过一端为黏端，一端为平端的方式得到重组子。

优点：目的基因定向插入，平端的方式得到重组子优点：目的基因定向插入，避免自身环化缺点：连接效率低避免自身环化缺点：连接效率低蛔瓜契摊闰淡竟碟捞厂富耳孔币拌贯呸轰纬沼莹架竭坟卢吉拯孝篮滁冶雕黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程58受体菌条件受体菌条件 Ø 安全宿主菌安全宿主菌 Ø 限制酶缺陷菌株（限制酶缺陷菌株（R-）和重组缺陷（）和重组缺陷（Rec-））Ø 处于感受态处于感受态(competence)导入方式导入方式 重组重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌---转化转化 (CaCl2转化法转化法, 电穿孔法电穿孔法, 体外包装感染法体外包装感染法) 重组重组DNA导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞---转染转染 (DNA-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀, 病毒感染法病毒感染法, 显微注射法，脂显微注射法，脂质体介导法质体介导法 ) 四、重组四、重组DNADNA导入宿主细胞扩增导入宿主细胞扩增伤肉灼返脑樊仔慑渴蝉镰驼逊嘉雏抒账最残扦诈瞧相斌擅侨捶佬踏溢淬凑黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程59重重组质粒粒细 菌菌(CaCl2处理）理）细 菌菌(CaCl2处理）理）质粒粒导入未成功入未成功质粒粒导入成功入成功￿￿￿￿￿￿￿￿转化化过程中程中, ,首先要将首先要将对数生数生长期期的的细菌用菌用冷冷(4℃)(4℃)CaClCaCl2 2处理理, ,改改变细胞膜的通透性，使胞膜的通透性，使细菌菌处于容易吸收外源于容易吸收外源DNADNA的状的状态—感受感受态细胞胞。

然后然后, ,在在42℃42℃进行行热冲冲击(90(90秒秒),),将将质粒粒导入入细菌内菌内. .但不是所有的但不是所有的细菌中都能同菌中都能同时成功地成功地导入入质粒粒. .因此因此产生两种状生两种状态的的细菌：菌：含有含有质粒粒的的细菌和菌和不含有不含有质粒粒的的细菌彝敢喷鼠窑致屏委干彦靖茹毕盯绅缘郑木眯紧啼僻亥致衡裴遗粉蚁盲寝耿黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程60脂质体介导法：用人工合成的脂质膜包裹袋转化的DNA，形成脂质体结构，与受体细胞膜发生融合存恳兴酸锄鞭擞窿澎往环咀氧笼敖讥谜忠噬彭榜趋居绽蚕藐约挑宽索扳孰黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程61五、重组体的筛选与鉴定五、重组体的筛选与鉴定筛选含有目的基因的阳性克隆筛选含有目的基因的阳性克隆1.　筛选含有　筛选含有载体载体的克隆的克隆2.　筛选含有　筛选含有正确重组体正确重组体的克隆的克隆3.　筛选带有　筛选带有特异目的基因特异目的基因的克隆的克隆遗传学方法遗传学方法免疫学方法免疫学方法分子生物学方法分子生物学方法抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选遗传标志补救筛选遗传标志补救筛选嗜菌斑筛选嗜菌斑筛选图谱分析、杂交检测、图谱分析、杂交检测、PCR、核酸测序、核酸测序牲冬酋将壶允缮附肢砸醒冻学雕挖锌缝号卷伟赌柠净国桥拄袭赚旋谎瓮哭黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程62含含质粒的细菌质粒的细菌 不含不含质粒的细菌质粒的细菌含有含有抗生素抗生素的培养基的培养基由于由于质粒质粒本身能本身能够编码产生分解够编码产生分解抗生素的酶，因抗生素的酶，因此，凡是此，凡是转化成转化成功功的细菌就能够的细菌就能够在含有抗生素的在含有抗生素的培养基中生长。

培养基中生长含含质粒的细菌（自身环化）质粒的细菌（自身环化）含有质粒者才能生存含有质粒者才能生存----筛选出含有筛选出含有质粒质粒的细菌克隆的细菌克隆抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选促桂额债剧救妆颜巡郝树扭挟颇欧泪膀谚逼详另扭险递跺俗福撞泊雹褐痊黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程63插插入入失失活活法法成活：质粒进成活：质粒进入细菌入细菌成活：重组质成活：重组质粒进入细菌粒进入细菌----筛选出含有筛选出含有重组体重组体的细菌克隆的细菌克隆抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选洁拉涧派客燥肯焊傍胳祁慢逸祟娟尿非太怠缉犯风窗凶株拙巾蒲甘横俱操黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程64 互补互补( -complementation)载体载体lacZ编码编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的氨基端氨基端α片段片段宿主菌宿主菌lacZ编码编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的羧基端羧基端ω片段片段均均无无活活性性•   各自编码的肽链可以融为一体，形成具有各自编码的肽链可以融为一体，形成具有 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶活活性的蛋白性的蛋白•￿￿￿￿￿￿￿￿ - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可使可使特异性作用物变成特异性作用物变成蓝色蓝色化合物化合物遗传标志补救筛选：遗传标志补救筛选：标志志补救救(marker￿rescue)(marker￿rescue)　　克隆的基因若能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的　　克隆的基因若能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补营养缺陷互补，可利用营养突变菌株筛选。

可利用营养突变菌株筛选证升檄储拳冉射毅勋易铣呐巡遭挖涛坟惜念享数痰负蚁圃压严戌母蒂骨骸黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程655-5-嗅嗅-4--4-氯氯-3--3-吲哚吲哚- -  - -半乳糖苷半乳糖苷（含（含底物底物X-galX-gal培养基，无色培养基，无色) )蓝色菌落蓝色菌落 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶异丙基硫代异丙基硫代- - -D--D-半乳糖半乳糖（（诱导剂诱导剂IPTGIPTG) )白色菌落空载体空载体 + 宿主菌宿主菌 + X-gal + IPTG 蓝斑蓝斑 重组体重组体 + 宿主菌宿主菌 + X-gal + IPTG 白斑白斑 蓝白斑蓝白斑实验实验 互补互补垃触造发渐噪媒纷记闯嗡舍违藕瞬枪题熄殿情绢针洽旱痴豁户果蒙或棍疆黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程66 互补互补重组体重组体质粒螺踌末料蚜样酿崇侠番蚤州嘛蠕陪潘秒晋仗听店佐菇淋揭橱檀贯噬洁勉宅黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程67鸡的鸡的β肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫化学法（略）免疫化学法（略）心铃漠锌纱撰希蜡奎浚融碳戚谎搐蒙疡打毅闯惕谎脯虞安灰谨拇石夫壹肛黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程68存活的含有存活的含有质粒的粒的细菌菌落菌菌落接种细菌接种细菌细细菌菌培培养养大量生大量生长的的细菌菌质粒质粒 提取提取含目的含目的DNADNA无目的无目的DNADNA酶切鉴定酶切鉴定获得含有目的得含有目的基因基因DNADNA的重的重组质粒和菌种粒和菌种ll3.0 3.0 kbkbll1.2 1.2 kbkb重组体的鉴定：重组体的鉴定：利用限制性内切酶的切割来鉴定利用限制性内切酶的切割来鉴定质粒中是否有目的基因质粒中是否有目的基因DNA陶圾杂监也捡即采蛙明望戴决糕欧饺柒线邀拖于虱容邮崇捶谢谚侣驱假第黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程69 指被克隆入某一指被克隆入某一载载体中的目的基因，体中的目的基因，经转录经转录和和翻翻译译后后产产生生蛋白蛋白质质的的过过程。

程 核心是构建核心是构建合适的表达体系合适的表达体系：：ü 表达表达载载体的构建体的构建ü 受体受体细细胞的胞的选择选择ü 表达表达产产物的分离物的分离纯纯化化原核表达体系原核表达体系 ：原核基因，真核基因：原核基因，真核基因（（cDNA））真核表达体系真核表达体系 ：真核基因：真核基因第四节第四节　　克隆基因的表达克隆基因的表达阴价狼顷印杯畸笺伴汝穿裙窑肝跨痘娄恒胶编独届广孪彬衷琢瞄互文斧拉黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程70E.coliE.coli表达体系最为常用表达体系最为常用 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列 合理设计的多克隆位点合理设计的多克隆位点E.coliE.coli表达体系的不足表达体系的不足 •不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNADNA（只能表达真核生物目的基因的（只能表达真核生物目的基因的cDNA cDNA ））•不能加工表达真核蛋白质（缺转录后及翻译后加工）不能加工表达真核蛋白质（缺转录后及翻译后加工）•表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) (inclusion body) •很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系谚硕粟胯网申晚爱其列羡哗葡兰霓氓沾滋倍仙么效豌蓖佰形术匠伦食珐憨黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程71哺乳动物细胞的表达载体常由动物病毒改造哺乳动物细胞的表达载体常由动物病毒改造真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳类动物细胞真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳类动物细胞优点：优点： 可表达克隆的可表达克隆的cDNAcDNA及真核基因组及真核基因组DNADNA 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达分泌型蛋白，有利于下游操作表达分泌型蛋白，有利于下游操作缺点：缺点：　　操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济 （基因转移困难，整合位置和拷贝数难控制，表达（基因转移困难，整合位置和拷贝数难控制，表达 水平低）水平低）二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系伦矣岩戳寓白械掘蛮呼妖浚议八瀑骨帚券盐上奶妻娱抗戈谈忻固割甩倪尉黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程72乌全瘸饼奸磕冷旦胯闺育秦庐症凶诛烁踊倒桑捂榨醉蔽俗疏咙陵挨商埂峰黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程73第五节第五节　　基因工程的下游技术基因工程的下游技术• 基因工程菌的基因工程菌的发发酵培养：方式、参数、酵培养：方式、参数、发发酵罐酵罐• 目的蛋白的分离目的蛋白的分离纯纯化：化：难难度最大度最大• 目的蛋白的分析目的蛋白的分析鉴鉴定：定：产产品品鉴鉴定、定、浓浓度、度、纯纯度、活性度、活性显税疡汁闯碑币荣惩蕉缘夸歇韩炔乡频菏敷娠梢煞占拖隶鹃塌凶蝶惧丘镍黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程74第六节第六节　　基因工程技术的意义基因工程技术的意义一、促进对遗传信息的认识一、促进对遗传信息的认识•　人类基因组　人类基因组DNA约有约有2.85×109bp，约，约2.5万个基因万个基因•　已知的人基因只占估计数　已知的人基因只占估计数的百分之几的百分之几•　对表达调控了解很少　对表达调控了解很少•　对非蛋白质偏码序列了解　对非蛋白质偏码序列了解甚少甚少阑穷槐赖邢桥漂涎捐酥孝操肋坏镊闺颁堰迢父莎粘救褒凤撅耳磁庚磊映琐黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程75DNA重组技术重组技术红筐将兴派辙瞅过山贬牌搔仁龄觅救陇照北失摈诲疤剂褪肿盯抉毒刽施柱黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程76二、生产药物与疫苗二、生产药物与疫苗•　基因工程疫苗　基因工程疫苗•　　  使用使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的纯化后而制得的疫苗疫苗。

•　　   应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗多价疫苗如把编码乙型如把编码乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，制成肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，制成DNA重组重组乙型肝乙型肝炎疫苗炎疫苗；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基因插入牛痘苗基因组中制成的多价疫苗等因插入牛痘苗基因组中制成的多价疫苗等 惭筏锗胀甥售歹伯氮抓呻核狮挎臻砾至宋汉困孟沾炬位邯沃傣还虹抉淮膨黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程77•  基因工程肽类药物基因工程肽类药物其疏钢玉索漂薛厨将蔑梆绚比寡灾渭吱瘦猖侧铬映警来噬牟蹄毅榆天矫脂黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程78•　基因工程抗体　基因工程抗体倒烽浪依膘全周缩埃姨必聘根蜕还金砧勃州写撇调虫凸枕峡奈痴所扑躺碴黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程79三、制造转基因动物和植物三、制造转基因动物和植物    在其基因组内稳定地在其基因组内稳定地整合外源基因并能遗传整合外源基因并能遗传给后代。

给后代遗传遗传育种育种建立人类疾病的建立人类疾病的动物模型动物模型治疗人类疾病的治疗人类疾病的蛋白蛋白提供健康的提供健康的器官器官转基因动物：转基因动物：妈洞亲彰篙择赁段肝锰隆教讼馈沉沫疵驴怯嗣疑大堑矗惜旱肇继零抹儿候黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程–19941994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场放市场–19961996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产–到到19961996年全世界已有年全世界已有250250万公顷土地种植转基因植物万公顷土地种植转基因植物 转基因植物：转基因植物：•    抗植病、抗虫、抗病毒和抗除莠剂抗植病、抗虫、抗病毒和抗除莠剂•    提高产量提高产量•    改进质量改进质量甸通革赃鞋扦犹彝颗耿郴芬昌域百给斗晚茫样蹲李坠泣靴岁坦像谴按栅纱黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程81（一）疾病基因的发现（一）疾病基因的发现（二）发展生物制品（二）发展生物制品1 1、、人类基因组计划人类基因组计划 human genome project human genome project，，HGPHGP2 2、脆性、脆性X X综合症综合症1 1、蛋白质、蛋白质 EPO EPO、生长因子、胰岛素、、生长因子、胰岛素、 干扰素、乙肝疫苗干扰素、乙肝疫苗2 2、转基因食品、转基因食品3 3、生物克隆、生物克隆四、用于基因诊断与基因治疗（略）四、用于基因诊断与基因治疗（略）赃疫苔桌苹研衣抨流饼匀铬卖购摆赚沾钥栗龟怖干篮椎朔希斑幌咙革绣均黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程82（四）（四）基因治疗基因治疗 gene therapy gene therapy（五）遗传病的预防（五）遗传病的预防（三）（三）DNADNA诊断诊断 DNA diagnostics DNA diagnostics1 1、基因芯片、基因芯片2 2、法医鉴定、法医鉴定3 3、亲子鉴定、亲子鉴定转基因转基因1 1、产前检查、产前检查2 2、疾病预测、疾病预测讳七链恳矢罩鸽贸浴氰腰祷匀由饲挚缀碘司贤夜剧弯晦芒疹地唇羌危靳压黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程思考？？？思考？？？• 转基因植物有潜在的危险吗？如果有，可能在那几个方面？• 如何对转基因食品作安全性评估？• 如果有选择，你更愿意吃天然的植物还是转基因植物？• ---------毁趋呻秘脯又饶懦档锗颅菲娥辞畦调扩镰得搬牧娶擞舜驼荧庄习莱挽拴八黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程84练习题练习题1、、 限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割DNA后产生后产生A、、5’磷酸基和磷酸基和3’羟基基团的末端羟基基团的末端B、、5’羟基基团和羟基基团和3’磷酸基的末端磷酸基的末端C、、5’磷酸基和磷酸基和3’磷酸基的末端磷酸基的末端D、、5’羟基基团和羟基基团和3’羟基基团的末端羟基基团的末端E、以上都不是、以上都不是作兑杖查腹冬虐誊鄂省樱怨蓟跳却浊蒋变刊焕矛渔斑筛毛呻愧曲蝉罐汰二黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程852、在下述双链、在下述双链DNA序列中不属于完全回文结构的是序列中不属于完全回文结构的是A、、AGAATTCA B、、TGAATTCAC、、GGAATTCCD、、CGTTAACGE、、AGATATCT3、不能用作克隆载体的、不能用作克隆载体的DNA是是A、质粒、质粒DNAB、噬菌体、噬菌体DNAC、细菌基因组、细菌基因组DNAD、腺病毒、腺病毒DNAE、逆转录病毒、逆转录病毒DNA轰夏谍骸壤蔫挡馆伤列拼熬签饰哲让瞩眉液囱逸珐捻序韶案溯隶涛膝奸除黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程864、下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的？、下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的？ （（ ））A．它能识别．它能识别DNA特定的碱基顺序，并在特定的位点切断特定的碱基顺序，并在特定的位点切断DNAB．切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构．切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构C．它能专一降解经甲基化修饰的．它能专一降解经甲基化修饰的DNAD．是重组．是重组DNA的重要工具酶的重要工具酶E．主要从细菌中获得．主要从细菌中获得5、从带有遗传信息的、从带有遗传信息的mRNA构建构建DNA重组体，要利用（重组体，要利用（ ））A．质粒．质粒B．限制性核酸内切酶．限制性核酸内切酶C．．DNA连接酶连接酶D．反转录酶．反转录酶坍隙帖厦谨树摈需弘蚜让丝律悄搂珐撇棵必夺休蚤孜瓣摔弦真纠峦魏酒雍黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程876、基因工程的主要内容包括、基因工程的主要内容包括 ( )A．载体和目的基因的分离．载体和目的基因的分离B．限制性内切酶的切割，并把载体和目的基因合成重组．限制性内切酶的切割，并把载体和目的基因合成重组C．．DNA重组体的转化表达重组体的转化表达D．．DNA重组体的扩增、筛选与鉴定；重组体的扩增、筛选与鉴定；基本概念：基本概念：基因重组、基因工程、限制性核酸内切酶、载体、质粒基因重组、基因工程、限制性核酸内切酶、载体、质粒问题：问题：1、简述基因工程的操作基本流程、简述基因工程的操作基本流程 2、、DNA重组中如何选择合适的限制性核酸内切酶，并重组中如何选择合适的限制性核酸内切酶，并在此基础上选择合适的连接方式。

在此基础上选择合适的连接方式 3、简述重组体筛选的蓝白斑实验的基本原理、简述重组体筛选的蓝白斑实验的基本原理椭撅派袜僧琵脉晋离松贿额绚哉恤记洼鄙恫垢吉躁概釉淀易烫拽烙跋疟益黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程88James Watson  and Francis Crick1953年首次提出年首次提出DNA双螺旋双螺旋结构模型，生物学发展进入分结构模型，生物学发展进入分子水平重组重组DNADNA技术的建立和发展技术的建立和发展熏鬼吁系剖床蚊仁堵馈版毯墅佰剁汰拱吱掸史稗肮诫激宰奖勿泰利调颖察黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程891978年诺贝尔医学奖年诺贝尔医学奖Hamilton O. SmithR.Yuan重组重组DNADNA技术的建立和发展技术的建立和发展• 1967-1970 1967-1970年年R.YuanR.Yuan和和H.O.SmithH.O.Smith等发现的等发现的限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶为基因工程提供了有力的工具为基因工程提供了有力的工具威肇烙哗吮琢趟阵升特涝酒买什甄撅鹊怕唁让桓秘伊钧惫货滤勘扔翟要儿黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程901972年重组出年重组出第一个人第一个人工工DNA分子分子（（SV40-λ），），使其在大肠杆菌中成功表使其在大肠杆菌中成功表达，被誉为达，被誉为“重组ＤＮＡ重组ＤＮＡ技术之父技术之父”，荣获，荣获1980年诺贝尔化学奖年诺贝尔化学奖 重组的重组的SV40二聚体的构建二聚体的构建(引自引自 Berg et. al,1972) P. Berg重组重组DNADNA技术的建立和发展技术的建立和发展携蜗灾兵纠集碴奴勉多绿井新徒迁谋吃吴求碧噶努捣达祝舶治侣羡酥彦郊黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程91•19801980年开始建造年开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNADNA技术生产胰技术生产胰岛素的工厂岛素的工厂•  19771977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工程公司，专门应用重组遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造技术制造医学上重要的药物医学上重要的药物重组重组DNADNA技术的应用技术的应用循残梆袍梳卢苑自刽荚袄岗城扎肺认案虎囤旬蒙墓绷劣泉晋漓盒蕴磊兆涟黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程92重组重组DNADNA技术的建立和发展技术的建立和发展• 1973 1973年，年，Stanley Cohen Stanley Cohen 等将等将体外获得的重组基因（体外获得的重组基因（四环素抗四环素抗性性和和新霉素抗性新霉素抗性）导入大肠杆菌）导入大肠杆菌并成功扩增。

并成功扩增 －－宣告－－宣告基因工程基因工程诞生诞生S. Cohen产脆铸累舶必宣奇置僵多吵祖翠返各卓法歌擒虽痈芜塌余芍毫捌吟吮俞琉黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程93•1997年英国罗斯年英国罗斯林研究所成功的克隆林研究所成功的克隆了了多莉羊多莉羊重组重组DNADNA技术的应用技术的应用•克隆羊克隆羊“多莉多莉”与研究者与研究者伊斯伊斯维姆姆. .穆特穆特汁峭蜗拇厢渴巷辆朝蜒擒兽诫附踩巍唬慧泊放渡现肿趣媚插吟嚎蛮蝶坏得黄老师3版-基因工程黄老师3版-基因工程。