漆酶的结构与催化反应机理.pdf

10． 3969/j． issn． 1000 －7067． 2012． 04． 002漆酶的结构与催化反应机理*靳 蓉 张飞龙( 西安生漆涂料研究所 ， 陕西 西安 710061)摘 要 : 漆酶是一种广泛分布的多酚氧化酶 ， 主要由单一多肽 、铜离子活性中心 、糖配基组成 多肽链一般含有 18种氨基酸 ， 构成漆酶的结构主体 ; 糖配基因漆酶的来源不同而异 ， 是漆酶多样性的标志之一 漆酶活性中心的铜离子依据光学和磁学特性被分为 3 种类型 :Ⅰ型或蓝型铜 ，Ⅱ型或通常型铜 ， Ⅲ型或偶联的双核型铜 漆酶的催化反应机理主要包括酶对底物的电子提取 、电子的传递和氧分子对酶的还原三步 ， 是一个通过电子转移发生氧化还原反应的过程 关键词 : 漆酶 ; 结构 ; 催化机理 ;Abstract: Laccase is one kind of polyphenol － oxidase distributed widely． It is mainly composed of sin-gle peptide， copper ions active center and sugar genin． There are 18 kinds of amino acid in the peptide gen-erally， making up the structure body; sugar genin， as one of the signs of diversity， differs in laccases． Thecopper ions in the acticve center are divided into 3 types based on optical and magnetic properties: typeⅠorblue type copper， typeⅡor usually type copper， typeⅢ or coupling double － core copper． The catalysis oflaccase is redox reaction through electron transfer， generally including the electronic extraction of substrate，the transmission of electrons ， enzyme reduction by O2． Factors like temperature， pH， buffer system， acid，inhibitors， etc． all have an effect on the catalytic ability of laccase．Keywords: Laccase; Structure; Catalytic mechanism漆酶是最简单的含铜多酚氧化酶 ， 能溶于水 ， 除柄孢漆酶是四聚体外 ， 大多数漆酶为单体酶［ 1］。

漆酶在结构上主要由单一多肽 、铜离子活性中心 、糖配基组成［ 2 －3］铜离子与特定的氨基酸残基配位组成活性中心 漆酶的氨基酸序列同源性差异很大 ， 但不管何种来源 ， 漆酶催化位点的氨基酸序列非常保守 ， 其参与底物识别与催化反应的核心结构相似 ， 表现在 DNA 水平上 ， 参与编码核心蛋白质的核酸序列也具相似性［ 4］漆酶的催化底物较为广泛 ， 主要包括酚类 、芳胺类 、羧酸类 、甾体类以及其他一些类别 ， 在生漆中 ， 漆酶是催化生漆固化成膜的生物促进剂 近年来随着漆酶催化介导体系的引入 ， 使其催化底物范围进一步扩大 ， 漆酶的应用领域及经济价值也得到了进一步的扩展和提升 1 漆酶的结构酶的结构具有多维性 ， 漆酶也不例外 漆酶的一级结构指的是其氨基酸序列 ， 亦即漆酶单一肽链的线性组成 ， 其中涉及漆酶重要功能的氨基酸组成在不同种类的漆酶间有一定的相似性和保守性 ， 这种保守性在判定漆酶同源性和物种进化中有着重要地位 漆酶的二级结构指漆酶肽链折叠的规则方式 ， 主要是熵效应的驱动 ， 与一级序列密不可分 ， 常见有 α 螺旋 、β 折叠 、β 转角以及无规卷曲等类型 在二级结构基础上 ， α 螺旋 、β 折叠等二级结构元件62012 年第 4 期 靳 蓉等 : 漆酶的结构与催化反应机理* 收稿日期 : 2012 －06 －12基金项目 : 国家 “十二五 ”科技支撑计划项目 ， 项目编号 : 2011BAD33B03搭配构成漆酶的结构域 。

这些结构域彼此作用构成漆酶的三级结构 1．1 漆酶的肽链及其糖基化漆酶一般由单一多肽组成 ， 大约含有 500 ～ 550个左右的氨基酸 ， 表观相对分子质量主要集中在 5 ×104～105之间［ 5］， 由 18 种氨基酸组成 : Pro、Lys、Arg、Asp、Ser、Phe、Leu、Thr、Val、Ala、Cys、Met、Ile、Gln、Tyr、His、Gly、Try［ 6］不同来源的漆酶 ， 其氨基酸序列相似性并不高 ， 例如子囊菌漆酶与担子菌漆酶的序列相似性仅为 20% ～ 30%［ 7 －8］， 但与铜原子相连的 1 个 Cys 和 10 个 His 及其周围的氨基酸配基则相对保守 研究发现漆酶的氨基酸组成有 4 个特征序列区( 表 1 的 L1 － L4) 可以用来从分子水平鉴别漆酶［ 9］( 表 2) 这些序列是通过对上百个漆酶的序列比对和分析发现的 ， 与铜离子结合的常见氨基酸残基均位于这 4 个区域 ， 其中 L2 和 L4 与报道的多铜氧化酶特征序列相符 ， L1 和 L3 则与漆酶特有序列区相符［ 10］表 1 漆酶特异性序列［ 10］L1 64 H － W － H － G － X9 － D － G － X5 － QCPIL2 104 G － T － X － W － Y － H － S － H － X3 － Q － Y － C － X － D － G － L － X － G － X － ( FLIM)L3 400 H － P － X － H － L － H － G － HL4 450 G － ( PA) － W － X － ( LFV) － HCHI － DAE － X － H － X3 － G － ( LMF) － X3 － ( LFM)根据对漆酶已知空间结构的比对 ， 也鉴定出与底物结合相关的序列区 ( 表 2) 。

相对于 L1 － L4 的特征序列区 ， 这些区无论是一级序列 、空间位置还是长度都有着较为明显的不同 葛宏华等人解析的栓菌 Trametes sp． AH28 － 2 的 LacB 晶体结构 ( PDB 注册号为 3KW7) 具有较长的 loop IV， 使得底物结合区域延伸 ， 其上强负电荷在漆酶表面形成一个凸起 ， 可能被用于调节底物的结合 表 2 漆酶的底物结合 loop 序列比对［ 10］蛋白质底物结合 loopsloopⅠ loopⅡ loopⅢ loopⅣ1GYC 159GPRFPLG 261ANPNFGTVGF 332FNFTNFF 386ATALAPGAP1KYA 159GPAFPLG 261ANPNFGNVGF 332FNGTNFF 386ATAAAPGAP1A65 159IQGAAQ 261AQPNKGRNGLAGTF 332FSGGRFT 389AGVLGGP2HRG 159GSPVPTA 261ALPNSGTRNF 332FAGGKFT1 385ATAAAPGFP2QT6 159FPRFPKG 261ANPNFGTTGF 332FDGTNFFI 385ATTAAPGAP3FPX 159FPRFPGG 261ANPNFGNVGF 332FNGSNFFI 386ATAAAPGAP3KW7 159GPAFPPN 261AIPNTGT1DY 332FNGTNFFI 386ITTVNGVTNAPGAP目前 ， 关于漆树漆酶结构的研究 Kazutomo Nitta等人［ 11］报道过 。

他们通过逆转录漆树枝叶的 mRNA构建了漆树 ( Rhus vernicifera) 的 cDNA 文库 ， PCR 扩增得到 cDNA 克隆 ， 尽管漆树漆酶至少有 3 种同工酶 ， 但是该方式仅研究到其中一种 他们发现该漆树漆酶克隆包含一个由 1599 个核苷酸组成的阅读框 ， 它编码一个由 533 个氨基酸组成的蛋白质 ( 图 1) ， 分子量达到 58981Da( 不包括铜离子 ) 完整的漆树漆酶是一个糖蛋白 ， 含有 45%的碳水化合物 ， 15%的可能性糖基结合位点都有 Asn－ X － Thr 模式 ( Asn5、14、28 等共计 15 个 ) 在氨基酸水平上该漆树漆酶与其它植物漆酶具有 42% －62%的相似性 ， 而与微生物漆酶仅有 20%－24%的相似性［ 12 －15］Nitta 等人推测漆树漆酶与植物漆酶相似性高 ， 而与微生物漆酶相似性低的原因可能与功能有关 : 植物漆酶一般是用漆酶聚合漆酚类物质以达到伤口愈合的目的 ， 而微生物更偏向用漆酶进行色素合成 、木质素降解和解毒等 他们还就植物漆酶作了进一步的同源性比对 ， 发现在选择的 5 个样品中 ， Rhus vernicifera 漆酶与美国梧桐 ( A-cer pseudoplatanus) 的同源性最高 ， 达到 62%， 在遗传进化树上表现为单独的一个簇 ， 而其他的胶杨 ( Pop-ulus trichocarpa) 、普通烟草 ( NicoT1ana tabacum) 、北美鹅掌楸 ( Liriodendron tulipifera) 、火炬松 ( Pinus tae-7第 31 卷 第 4 期2012 年 12 月中国生漆Journal of Chinese LacquerVol．31 No．4Dec．2012da) 则聚为另外一簇 ( 图 2［ 11］) 。

图 1 漆树漆酶 cDNA 序列及推测的氨基酸序列［ 11］图 2 漆树漆酶与其他植物漆酶的系统发育树［ 11］在一级结构上 ， 与微生物漆酶不同的是 ， 漆树漆酶利用一个 Met 残基参与构成漆酶中 I 型 Cu 位点 相比微生物漆酶 I 型 Cu 位点 780 mV 的高氧化还原电位 ， 推测漆树漆酶 480 mV 低氧化还原电位可能与Met 的加入有关 与灰盖鬼伞 ( Coprinus cinereus) 漆酶 、疣孢漆斑菌 ( Myrothecium verrucaria) 胆红素氧化酶 、人血浆铜蓝蛋白 、西葫芦 ( zucchini) 抗坏血酸氧化酶 、酵母 Fet3 的金属结合位点氨基酸序列比对结果显示 ， 该漆树漆酶的 Ⅱ型 Cu 位点的 2 个 His 配基和III 型 Cu 位点的 6 个 His 配基完全保守 此外 ， 铜离子间桥接处或与 His 配位的氨基酸均相同或类似 ， 表明他们在活性位点的构建与影响酶活性的过程中具有重要作用 ， 因此也预示了研究漆酶反应机理时这些氨基酸位点可以作为突变对象 该漆树漆酶的二级结构是用 PHDsec 在 EMBL提供的蛋白预测平台上根据一级序列预测的 。

其中β 片 ( β － sheet) 约占 28． 7% ， 圈环和其它随机结构占到了 67． 0%， 而 α 螺旋 ( α － helix) 仅占到了4．3%， 表明漆树漆酶的一个同工酶二级结构中主要是 β 片 、增加的圈环和随机结构 这些二级结构的位置与抗坏血酸氧化酶及微生物漆酶都非常相似 ，表明该漆树漆酶的立体空间结构可能与已经被解析的多铜氧化酶相似［ 11］不同的漆酶分子的有不同程度的糖基化 ， 其含糖量和种类因来源不同而异 不同植物或真菌 ， 或同一植物因其部位的不同 ， 或同一部位漆酶多基因家族成员的不同 ， 漆酶糖基均有差异 ， 从而导致漆酶分子量的显著差异 大部分漆酶中的糖基含量约为10% ～25%，。