阿霉素小鼠肾病模型的建立及IL18结合蛋白干预的实验研究.doc

1阿霉素小鼠肾病模型的建立及 IL18 结合蛋白干预的实验研究作者：董孟华 刘志学 孟祥辉 栾希英【摘要 】 目的 建立阿霉素小鼠肾病模型并探讨 IL 18 结合蛋白(IL 18BP)通过结合内源性 IL 18 对该模型的干预机制 方法 昆明种小鼠 30 只，随机分为正常对照组、阿霉素肾病造模组（ADR MCN 组） 、IL 18 结合蛋白治疗组（IL 18BP 治疗组）3组，用阿霉素 7.5 mg/kg 尾静脉注射进行造模，治疗组于第5、7 、12 、21 天腹腔注射 0.5 mg/kg 剂量 mIL 18BP（鼠源性IL 18 结合蛋白） ，隔周检测尿蛋白一次，观察并记录其生命体征；42 d 后心脏采血处死小鼠，分离血清 ELISA 法检测相关细胞因子和生化指标结果 ①ADR MCN 组 24 h 尿蛋白定量（ UPE）明显升高，与正常对照组及 IL 18BP 治疗组相比均有显著性差异（P ＜ 0.01） ②ADR MCN 组血清中甘油三酯（ TG） 、总胆固醇（TC）显著高于正常对照组、IL 18BP 治疗组（P＜0.01） ，总蛋白（TP） 、白蛋白（ALB）显著低于后两者（P＜0.01） ，尿素氮（BUN） 、肌酐（Scr）含量各组间无显著性差异（P＞0.05） ；③IL 18BP 治疗组血清 IL 18 水平比 ADR MCN 组明显降低2（P ＜ 0.01） ，且与 24hUPE 呈显著正相关（r=0.708，P＜0.01） 。

结论 ①昆明鼠微小病变性肾病模型建立②IL 18BP 可通过特异性结合内源性 IL 18 抑制其下游致炎因子的释放，对阿霉素肾病模型发挥干预作用，从而调节免疫平衡，改善肾脏功能 【关键词】 微小病变型肾病综合征；阿霉素；IL 18 ；IL 18 结合蛋白【Abstract】 Objective To explore the experimental therapeutic effect machanism of IL 18BP through binding endogenous IL 18 on ADR induced nephropathy in mice.Methods The 30 KunMing mice were divided into 3 groups randomly:Blank group,Model group（ADR MCN group）and Therapy group(IL 18BP group). The Model and Therapy group were induced to nephropathy model by single injection of ADR (7.5 mg/kg) through tail vena，and then the mice of Therapy group were treated with mIL 18 Binding Protein (mIL 18BP) with 0.5 mg/kg on day 5,7,12 and 21. Protein in uria was measured biweekly and objective sign of mice was recorded. All mice were sacrificed through getting blood from the heart on the 42 th day ater the first injection of ADR.Correlative cytokine and biochemical parameters were 3detected in serum.Results ①The 24hUPE of IL 18BP treated groups was significantly decreased as compared with that in ADR-MCN group, but still was significantly increased as compared with that in normal control（P＜0.01）.②In ADR MCN group, the levels of TG and TC were higher and TP and ALB were lower than those in IL 18BP theated groups in serum（P＜0.01）.The levels of BUN and Scr had no significant difference（P＞0.05）.③ In IL 18BP treated groups ,the level of IL 18 in serum was significantly decreased as compared with that in ADR MCN group（P＜0.01） and positively correlated with 24 hUPE.Conclusions ①ADR Nephropathy Model induced. ②IL 18BP has obvious therapeutic effect to ADR nephrosis mice through specifically binding IL 18,regulating immunologic balance,strengthening renal funtion.【Key words】 MCN, ADR,IL 18,IL 18BP微小病变型肾病综合征（MCN）发病机制至今仍未完全阐明。

大量研究［1，2］提示，多种免疫活性细胞产生的致炎因子，可能是造成肾脏病理损害及炎症反应的直接因素，其中 IL 18 作为上游致炎因子其水平与病情的进展高度相关，有望成为治疗研究的新的4靶分子，且 IL 18BP 中和内源性 IL 18 的作用已被证实［3］ 本实验利用昆明鼠建立阿霉素微小病变型肾病综合征模型［4］ ，再应用 mIL 18BP 对模型鼠进行干预，观察其疗效并进一步分析 IL 18等在疾病中的作用1 材料与方法1.1 实验动物 昆明种小鼠 30 只,体质量（ 20±2）g ，雄性，4～6 周龄随机分为正常对照组、阿霉素肾病造模组（ADR MCN 组） 、白介素 18 结合蛋白治疗组（IL 18BP 治疗组）3 组, 每组 10 只，用苦味酸分别标记，分笼饲养，喂养环境及食物等其他条件均完全相同1.2 造模方法 实验前先将小鼠分别放入代谢笼内饲养,禁食不禁饮, 收取 24 h 尿蛋白，然后将 ADR MCN 组、IL 18BP 治疗组于试验开始后一次性尾静脉注射阿霉素（深圳万乐药业有限公司,批号: H44024359，规格:10 mg/瓶）7.5 mg/kg, 正常对照组尾静脉注射等量生理盐水。

IL 18BP 治疗组于第 5、 7、12 、21 天腹腔注射mIL 18BP 0.5mg/kg［5 ］ ，同时 ADR MCN 组腹腔注射等量的0.1 M PBS并于第 14、28 、42 天分别收取 24 h 尿液作蛋白定量（双缩脲法） 51.3 检测指标 6 周后，将小鼠用 4%水合氯醛麻醉，心内取血处死，4 000 r/min 高速离心，取血清测定生化指标甘油三酯（TG） 、总胆固醇(TC) 、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB) 、尿素氮（ BUN） 、肌酐（Scr） ；ELISA 法检测 IL 18 水平1.4 统计分析 采用 SPSS12.0 统计软件包进行统计学分析，所有数据用 x±s 表示,组间比较采用 t 检验、ANOVA 检验及 Pearson相关系数检验，P＜0.05 有统计学意义2 结果2.1 一般情况 实验过程中, ADR MCN 组有 2 例死亡除正常对照组外,其余两组均有不同程度的摄食减少、精神不振、尿量减少、身体浮肿、卷毛、脱毛、体毛光泽度欠佳、活动迟缓等现象,以ADR MCN 组尤为明显2.2 动态 24 h 尿蛋白定量(24 hUPE)的测定 见表 1。

表 1 各组24 hUPE 的测定表 1 结果提示，阿霉素注射后小鼠于第 2 周尿蛋白开始升高，明显高于正常对照组（P＜0.01） ；第 4 周达高峰，并在整个研究期间维持高蛋白尿水平经 mIL 18BP 治疗后阿霉素肾病小鼠尿蛋白虽高于正常组（P＜0.01） ，但其研究期间 24 h 尿蛋白定量明显低于 ADR MCN 组（P＜0.01） 62.3 血清生化指标的测定 见表 2表 2 各组血清生化指标比较表 2 结果提示，与 ADR MCN 组比较，正常对照组 TP、ALB、 TG、TC 水平都有显著性差异 (P＜0.01)； IL 18BP 治疗组血清TP、ALB 水平有所回升(P＜0.01),TG、TC 水平有所降低(P ＜0.01)；但 BUN、Scr 指标各组间无明显差异(P＞0.05)2.4 血清中相关细胞因子 IL 18 的测定 见表 3表 3 血清细胞因子 IL 18 水平测定 注： 与 ADR MCN 组比较,*P＜0.01表 3 结果提示，与 ADR MCN 组相比，正常对照组和 IL 18BP治疗组血清 IL 18 水平较低，且均有显著性差异（ P＜0.01） 2.4 6 周末尿蛋白与血清 IL 18 水平的相关性 血清 IL 18 与 24 h 尿蛋白定量呈显著正相关（r=0.708 ，P ＜0.01） 。

3 讨论3.1 ADR MCN 小鼠模型的建立 ADR 模型是目前公认的较为成熟的人类 MCN 动物模型, 本研究首次选用了昆明种小鼠，在阿霉素造模后 2 周，小鼠 24 hUPE 逐渐升高,第 4 周达到高峰；同时表现为低蛋白血症和高胆固醇血症6 周后造模组肾脏病理切片光镜下出现肾小球轻度充血和/或肾小球内系膜细胞轻度增生，毛细血管腔7狭窄甚或闭塞；透射电镜下出现毛细血管腔内有红血球瘀积,内皮细胞肿胀，线粒体肿胀，基质坏死, 部分嵴排列紊乱、消失, 部分膜破损，数目减少，绒毛稀疏，肾小球脏层上皮细胞轻度肿胀，足细胞的足突融合成片甚至消失，基底膜增厚等病理改变结果从体征、尿蛋白、生化指标及光镜、电镜下的病理改变都接近人的微小病变型肾病综合征，证明 ADR MCN 模型成功建立 ADR MCN 组有两只小鼠死亡，可能是由于阿霉素的毒性作用引起了肾组织的急性损伤所致3.2 IL 18BP 对阿霉素肾病模型的干预作用 有研究表明［6］ ，IL 18BP 在体外能消除 IL 18 诱导的 IFN γ 和 IL 8 的产生以及对NF κB 的激活［ 7］,还能降低细菌引起的 IFN γ 的产生，将IL 18BP 注射给脂多糖处理的小鼠, 能降低其血循环中 IFN γ 和IL 8 的水平。

据报道［8～10］ ，IL 18 单克隆抗体、可溶性 IL 18受体及 IL 18BP 可应用于某些免疫相关疾病如 RA 的治疗本实验从细胞因子的角度审视肾病综合征的治疗，利用 IL 18BP 结合内源性 IL 18，选择恰当时机及合适剂量进行干预，从而从上游阻断局部致病因子，重建了内源性的免疫平衡研究中，经 mIL 18BP 干预后阿霉素肾病小鼠虽于第 2 周尿蛋白也开始升高，但同时从第 2周开始及其后研究期间 24 h 尿蛋白定量明显低于 ADR MCN 组；血生化指标检测结果也提示 IL 18BP 治疗组与 ADR MCN 组比较TP、ALB 水平有所回升,TC、TG 有所降低；IL 18BP 治疗组血清8IL 18 水平与 ADR MCN 组相比也明显降低，且 IL 18 水平与 24 h 尿蛋白定量之间呈显著正相关，与相关报道［11，12 ］一致以上结果都表明 IL 18 与 MCN 的发病之间有。