分光光度法检测蛋白质含量.ppt
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生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验曾季平曾季平生物化学与分子生物学系生物化学与分子生物学系 生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验n实验室规则实验室规则n实验室安全及防护实验室安全及防护n实验室常用玻璃仪器实验室常用玻璃仪器n实验考试实验考试 实验室规则实验室规则n提前提前5 5分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退分钟到实验室，不能迟到、早退、旷课，每迟到、早退一一次扣次扣1 1分，每旷课一次扣分，每旷课一次扣5 5分分n禁止在实验室内吃食品禁止在实验室内吃食品，如有违反者按迟到处理如有违反者按迟到处理n上课上课必须穿隔离衣必须穿隔离衣，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验，不能穿拖鞋和吊带背心，否则禁止进入实验室n实验期间实验期间必须设置在振动上必须设置在振动上，上课期间如急需接、打请，上课期间如急需接、打请到走廊上处理到走廊上处理n在实验室内要保持安静，不得嬉闹、大声说话在实验室内要保持安静，不得嬉闹、大声说话n认真预习认真预习n认真做实验认真做实验n养成良好的实验习惯（实验中、实验结束后）养成良好的实验习惯（实验中、实验结束后）n值日生工作值日生工作 实验室安全及防护实验室安全及防护n预防火灾预防火灾n预防中毒预防中毒n外伤外伤 实验室常用玻璃仪器实验室常用玻璃仪器n吸量管吸量管******( (示教示教) )n试管试管n烧杯烧杯n量筒量筒 实验考试实验考试实验课成绩实验课成绩实验课成绩实验课成绩平时表现平时表现平时表现平时表现实验测验实验测验实验测验实验测验原理原理原理原理实验报告实验报告实验报告实验报告 --------格式格式格式格式结果结果结果结果操作考试操作考试操作考试操作考试分析分析分析分析 实验报告网上提交实验报告网上提交n实验报告采取实验报告采取网上提交网上提交的方式，实验报告提交时间设定为的方式，实验报告提交时间设定为3 3天天，即本次，即本次实验结束后第三天晚上实验结束后第三天晚上1212点之前提交，点之前提交，过期无法再提交，本次实验报告过期无法再提交，本次实验报告则记为则记为0 0分分。
n尽早提交报告尽早提交报告，不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去不要等到最后期限，有时系统不稳定，可能提交不上去n直接将报告粘贴在框中直接将报告粘贴在框中，切记，切记不要以附件方式上传不要以附件方式上传，否则有可能文件打，否则有可能文件打不开，影响成绩不开，影响成绩n不要相互抄袭不要相互抄袭，一旦，一旦发现雷同卷则均记为发现雷同卷则均记为0 0分分n若过期没有提交报告，不要将报告发到老师邮箱，发也没用，最终实验若过期没有提交报告，不要将报告发到老师邮箱，发也没用，最终实验报告成绩只记系统导出的成绩报告成绩只记系统导出的成绩 实验一实验一分光光度技术及蛋白含量测定分光光度技术及蛋白含量测定 n理论理论 掌握分光光度技术的基本原理掌握分光光度技术的基本原理 了解分光光度计的基本构造了解分光光度计的基本构造n实验实验: : 利用分光光度技术进行蛋白质含量测定利用分光光度技术进行蛋白质含量测定 一、概念一、概念 利用物质特有的利用物质特有的吸收光谱吸收光谱来鉴别物质或测来鉴别物质或测定其含量的一项技术定其含量的一项技术 。
应用：应用：定性、定量定性、定量 优点：优点：灵敏度高灵敏度高 精确度高精确度高 操作简便、快速操作简便、快速 n 分光光度技术分光光度技术（（SpectrophotographySpectrophotography）） 二、工作原理二、工作原理v物质对光线有选择性吸收作用物质对光线有选择性吸收作用v每种物质都具有其特征性的吸收光谱每种物质都具有其特征性的吸收光谱v在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质在一定条件下，物质对光的吸收程度与该物质 的浓度成正比的浓度成正比 分光光度法所使用的光分光光度法所使用的光谱范范围：： 200nm200nm~ ~ ~ ~10µm10µm200200~ ~ ~ ~400nm400400nm400~ ~ ~ ~760nm760760nm760~ ~ ~ ~1010µm 紫外光区紫外光区可可见光区光区红外光区外光区 如何定性？如何定性？ ——利用利用吸收光谱曲线吸收光谱曲线鉴定化合物鉴定化合物 吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：吸收光谱曲线：吸收光谱曲线： 以不同以不同以不同以不同波长波长波长波长的的的的单色光单色光单色光单色光作为作为作为作为入射光入射光入射光入射光，，，，测定某一测定某一测定某一测定某一溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度溶液的吸光度，以波长为横，以波长为横，以波长为横，以波长为横轴，吸光度为纵轴作图，得到溶液的轴，吸光度为纵轴作图，得到溶液的轴，吸光度为纵轴作图，得到溶液的轴，吸光度为纵轴作图，得到溶液的吸收光谱曲线。
吸收光谱曲线吸收光谱曲线吸收光谱曲线 每种物质有其特征性的吸收光谱，每种物质有其特征性的吸收光谱，每种物质有其特征性的吸收光谱，每种物质有其特征性的吸收光谱，故可作为故可作为故可作为故可作为定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据定性分析的依据吸吸 光光 度度 1.1.朗伯朗伯（（Lambert））定律定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的厚度厚度增增加呈指数减少加呈指数减少 I1/I0=e-K1l2.2.比尔比尔（（Beer））定律定律 一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的一束单色光通过一光吸收介质时，其光强度随吸收光介质的浓度浓度的增加呈指数减少的增加呈指数减少 I1/I0=e-K2C I I0 0 : :入射光强度；入射光强度； I I : :透射光强度；透射光强度；l l ：介质厚度：介质厚度 C C ：介质浓度：介质浓度如何定量？如何定量？ — Lambert-Beer定律定律****** 3.Lambert - Beer定律定律***一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一束单色光通过某溶液时，光波被溶液吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比。
一部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比一部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比一部分，吸收多少与溶液的浓度和溶液厚度成正比 A=A=ε εCLCL A A：：：：吸光度；吸光度；吸光度；吸光度； C C：：：：溶液浓度；溶液浓度；溶液浓度；溶液浓度； L L：：：：液层厚度液层厚度液层厚度液层厚度 ε ε：：：：即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度即摩尔吸光系数，指一定波长时，溶液的浓度为为为为1 mol/L1 mol/L，光程为，光程为，光程为，光程为 1cm1cm时的吸光度值时的吸光度值时的吸光度值时的吸光度值 * * * *在在在在波长、溶液波长、溶液波长、溶液波长、溶液和和和和温度温度温度温度确定的情况下，确定的情况下，确定的情况下，确定的情况下，εεεε由物质由物质由物质由物质的特性决定的。
的特性决定的的特性决定的的特性决定的 4.4.计算计算******（（1 1））标准管法标准管法（标准比较法）（标准比较法） 实际测定过程中，用一实际测定过程中，用一已知浓度已知浓度的测定物按的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算测定管同样处理显色，读出吸光度，再根据前式计算 A标准标准= =εε标准标准C标准标准L标准标准 A样品样品= =εε样品样品C样品样品L样品样品 A：吸光度；：吸光度； εε：摩尔吸光度；：摩尔吸光度； C：溶液浓度；：溶液浓度； L：液层厚度：液层厚度 因标准液和样品液中溶质为同一物质，因标准液和样品液中溶质为同一物质， ε样品品= ε标准准 因盛标准液和测定液的比色杯径长相同因盛标准液和测定液的比色杯径长相同 L样品品=L标准准 故上二式可写成：故上二式可写成： A标准准/A样品品= ε标准准C标准准L标准准/ε样品品C样品品L样品品 C样品品=A样品品/A标准准 × C标准准 （（2 2）标准曲线法）标准曲线法 Ø绘制标准曲线：绘制标准曲线：配制配制一系列已知不同浓度一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度。
以溶液浓度为横座标，吸处理显色，分别读取各管吸光度以溶液浓度为横座标，吸光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线光度为纵座标，在方格座标纸上作图得标准曲线Ø获取样品的浓度：根据测得样品的吸光度值从标准曲线上获取样品的浓度：根据测得样品的吸光度值从标准曲线上获得测定物的浓度获得测定物的浓度 浓度吸光度 标准曲线使用注意事项标准曲线使用注意事项v标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间标准曲线范围在测定浓度的一半到二倍之间v吸光度在吸光度在范围内v所作标准曲线仅供短期使用所作标准曲线仅供短期使用v标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，避免误差产生避免误差产生 5．应用中注意的问题．应用中注意的问题******vLambert-beer’slawLambert-beer’slaw的偏离：该定律只适应于一定浓的偏离：该定律只适应于一定浓度范围，度范围，A A宜在宜在之间之间；；v 选择波长：选择波长：最大吸收波长最大吸收波长；；v 参比溶液（空白管）参比溶液（空白管）：消除背景效应，：消除背景效应，应包含除待测应包含除待测溶质以外所有的成分。
溶质以外所有的成分 空白管：空白管： 测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的测量过程中，因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸收，故设置一个光吸收，故设置一个空白管空白管，即其中除了待测溶质以外，，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同其它的成分完全相同 测量时，首先以空白管对准光路对仪器测量时，首先以空白管对准光路对仪器调零调零，既消，既消除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸除比色皿本身对光的吸收，又消除了非待测物对光的吸收，所测值即为待测物造成的光吸收收，所测值即为待测物造成的光吸收 n分光光度计分光光度计(spectrophotometer)一．基本部件一．基本部件单色器光源狭缝吸收池检测系统、测量装置钨灯氢灯棱镜光栅比色皿/比色池 二 、分光光度计使用步骤（示教）分光光度计使用步骤（示教） 三、使用时注意事项三、使用时注意事项**** 1. 波长波长选择 2. 机器机器预热预热 3. 不测量时，应使样品室盖处于开启状态不测量时，应使样品室盖处于开启状态，，否则会使光电管疲劳。
否则会使光电管疲劳 4. 不应把成有不应把成有腐蚀性液体腐蚀性液体的比色皿放在仪器的比色皿放在仪器表面 5. 比色皿使用注意事项比色皿使用注意事项******v 由于紫外光不能透过玻璃比色皿，由于紫外光不能透过玻璃比色皿，紫外光区紫外光区测测量时要量时要用石英比色皿用石英比色皿v 同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度同组使用的比色皿必须配套（规格、新旧程度一致）v 比色皿有比色皿有2 2光面与光面与2 2毛面，光学表面对准光路，毛面，光学表面对准光路，不能有任何污损，不能有任何污损，否则会引起光吸收的增加否则会引起光吸收的增加 v 比色皿中所盛溶液比色皿中所盛溶液不能太少不能太少，也，也不能太多不能太多，一，一般所盛液体约占全部容积的般所盛液体约占全部容积的2/32/3v 腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中腐蚀性溶液不得长期盛放在比色皿中v 每次使用后每次使用后, ,应立即倒空或以吸液泵吸干，然后应立即倒空或以吸液泵吸干，然后用水冲洗比色皿用水冲洗比色皿3 3～～4 4次 * * 本次实验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着本次实验，考马斯亮蓝可使玻璃比色皿着色，酒精浸泡后清洗。
色，酒精浸泡后清洗 蛋白质定量分析实验蛋白质定量分析实验 实验一实验一 双缩脲法双缩脲法测定蛋白质含量测定蛋白质含量 （（p50p50）） 实验三实验三 考马斯亮兰结合法考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量（测定蛋白质含量（p52p52）） 实验四实验四 紫外分光光度法紫外分光光度法测定蛋白质含量测定蛋白质含量 （（p53p53）） 实验一实验一 双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲法测定蛋白质含量【基本原理基本原理】 蛋白质分子中含有许多蛋白质分子中含有许多肽键，与双缩脲结构类似肽键，与双缩脲结构类似，，在碱性在碱性溶液中能与铜离子结合成溶液中能与铜离子结合成紫色紫色的化合物的化合物（称双缩脲反应）称双缩脲反应） 在一定浓度范围，在一定浓度范围，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，，故可故可用比色法测定蛋白质的含量用比色法测定蛋白质的含量 含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应 双缩脲法的灵敏度为双缩脲法的灵敏度为1-20mg1-20mg。
试 剂 （（mlml）） 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6标准蛋白准蛋白质溶液溶液0.10.10.30.30.50.50.70.70.90.9—生理生理盐水水0.90.90.70.70.50.50.30.30.10.11.01.0双双缩脲试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0【操作步骤】【操作步骤】（一）（一）（一）（一）标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制标准曲线的绘制1. 1. 1. 1. 取小试管取小试管取小试管取小试管6 6 6 6支，编号按下表操作支，编号按下表操作支，编号按下表操作支，编号按下表操作 2 2．．混合混合后，于后，于37℃37℃水浴水浴中放置中放置1515分钟，在分钟，在540nm540nm波长波长下比色，以下比色，以 第第6 6管管调零，测得各管的吸光度值以各管的吸光度值为纵调零，测得各管的吸光度值以各管的吸光度值为纵 座标，蛋白质浓度为横座标，绘成曲线座标，蛋白质浓度为横座标，绘成曲线 （二）样品测定：（二）样品测定： 取样品取样品0.1ml0.1ml，加生理盐水，加生理盐水0.9m10.9m1，再加双缩脲试剂，再加双缩脲试剂4m14m1，于，于37℃37℃水浴中放置水浴中放置1515分钟，测其吸光度，根据吸光度值查分钟，测其吸光度，根据吸光度值查标准曲线并计算得出标准曲线并计算得出样品中蛋白质的浓度。
样品中蛋白质的浓度 注意：注意：v双缩脲法的灵敏度为双缩脲法的灵敏度为1-20mg1-20mg，取蛋白标准液时注意浓度取蛋白标准液时注意浓度v实验时，实验时， 样品管可与标准管同时处理样品管可与标准管同时处理 【基本原理基本原理】 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色色它和蛋白质可通过范德华力结合，与蛋白质结合后颜色由红色转变成蓝色，最大吸收峰从由红色转变成蓝色，最大吸收峰从465nm变成变成595nm，能过，能过测定测定595nm处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量处的光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量 优点：优点：灵敏度高，灵敏度高，1-5μg；测定速度快；干扰物质少测定速度快；干扰物质少 实验三实验三 考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量考马斯亮兰结合法测定蛋白质含量 1．取试管取试管3 3支，编号按下表操作支，编号按下表操作 试试 剂（剂（mlml）） 空白空白 标准标准 标本标本 生理盐水生理盐水 0.1 0.1 蛋白标准液蛋白标准液(50ug(50ug／／ml) 0.1 ml) 0.1 2.2.混匀，放置混匀，放置5 5分钟，在波长分钟，在波长595nm595nm处，以空白管调处，以空白管调“0 0”，，测测定各管的吸光度。
定各管的吸光度操作步骤操作步骤】 3. 计算计算 A A标本标本/A/A标准标准××5050（（µg/mlµg/ml））==样品中蛋白质的含量样品中蛋白质的含量（（µg/mlµg/ml））注意：注意：蛋白标准液浓度蛋白标准液浓度50µg/ml50µg/ml 实验四实验四 紫外分光光度法测定蛋白质含量紫外分光光度法测定蛋白质含量【基本原理基本原理】 由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香由于蛋白质分子中含有酪氨酸，色氨酸等芳香族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸族氨基酸，因而蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在收高峰在280nm280nm波长波长处由于各种蛋白质所含芳香族处由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内，吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定峰的光密度值与其浓度成正比关系，可作定量测定 灵敏度：灵敏度：50-10050-100μμg g 【操作步骤操作步骤】（一）制作标准曲线（一）制作标准曲线 1. 1.取试管取试管6 6支，编号，按下表操作。
支，编号，按下表操作 试剂（试剂（mlml）） 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 标准蛋白质溶液标准蛋白质溶液 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6 6管调管调“0 0” ，在，在280nm280nm波长波长下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白下测定各管光密度，以各管的光密度值为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线图质浓度为横座标绘制标准曲线图二）标本测定：取标本（二）标本测定：取标本1.0ml1.0ml，加入生理盐水，加入生理盐水3.0ml3.0ml，测，测A A280280标准曲线标准曲线上读出浓度上读出浓度 1.1.颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中颈椎脱臼处死小鼠，剪开腹部，取出肝脏组织，置于平皿中用用PBSPBS清洗。
清洗2.2.称取称取100mg100mg肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中肝组织，剪碎，并转移到匀浆器中3.3.将将1mL 1mL 预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研预冷的裂解缓冲液加入匀浆器中，冰浴条件下充分研磨将组织研磨液转移到磨将组织研磨液转移到1.5mL1.5mL的离心管中的离心管中4.4.离心（离心（13000rpm13000rpm，，5min5min），取上清液转移至一新的），取上清液转移至一新的1.5ml1.5ml离离心管中，即为组织蛋白粗提取液心管中，即为组织蛋白粗提取液小鼠肝脏组织总蛋白的提取小鼠肝脏组织总蛋白的提取注意：注意：实验一实验一用原液用原液，，实验三和实验四实验三和实验四将原液进行将原液进行5050倍稀释 实验安排n1.获得蛋白样品：自己提取蛋白n2. 蛋白含量测定： 上午完成1-2个实验，下午1-2个。
