油滴和线粒体间作用探讨现状.doc

油滴和线粒体间作用探讨现状 油滴和线粒体间作用探讨现状预读: 摘要:最新杂志：高中生学习课外语文考试与评价苏州教育信息化中国数学教育中小学音乐教育中学课程资源中学教研中学生数学远程教育武汉教育学院学报芜湖师专学报引 言脂滴,也被称为油滴,普遍存在于各种物种的各种细胞中,是一种储存中性脂的亚细胞结构.根据细胞和含脂量的不同,脂滴的大小和种类也不同.以直径计算,脂滴的大小可从50 nm到 200 μm 不等[1].脂滴以中性脂为核,表面由单层磷脂覆盖[2],磷脂中镶嵌并覆盖有各种蛋白,调控着脂滴的功能及行为.以前,人们认为脂滴只是储存中性脂的惰性结构,但近期研究表明,脂滴比人们想象的要活跃得多.脂滴表面存在着多种与脂类代谢相关的酶类,这些蛋白可能会改变甘油三酯的合成和降解,合成其它脂质,导致某些脂类代谢的中间产物水平发生变化[3]；另外,有越来越多的证据表明,脂滴可以动态地与其它细胞器发生互相接触,尤其是内质网、线粒体、内涵体和过氧化物酶体[4～6].虽然这种相互作用的机制及功能还很不清楚,但不少假设都认为这种相互作用可以为细胞器之间交换脂类提供便利[5,7].在脂滴的动态变化中,脂滴和线粒体的相互作用受到了越来越多的关注.除了脂质交换外,脂滴与线粒体的相互作用在细胞的能量平衡中也发挥着重要作用.细胞摄取的脂肪酸能以甘油三酯的形式储存于脂滴中,当细胞需要能量时,脂滴中的甘油三酯会被水解生成脂肪酸,作为能源物质,经线粒体的β-氧化及氧化磷酸化作用产生 ATP,供给细胞能量.这个过程若是被病理条件所损害,就会引起细胞在脂类储存和代谢上的紊乱,损害线粒体的正常功能,导致细胞能量代谢失衡,破坏细胞的正常功能.因此,对储存脂类的细胞器———脂滴,以及氧化脂类的细胞器———线粒体相互作用的研究,将会有助于探索与肥胖相关的代谢类疾病的发病机理及可能的治疗方案.脂滴的组成及表面蛋白脂滴的内部主要由甘油三酯(triglyceride,TAG) 和胆固醇酯构成,还有其它一些中性脂,如醚酯[8].单层磷脂把脂滴有机相的内核与细胞质的水相环境隔离开,使脂滴成为一个独立的结构.脂滴的表面蛋白就结合在单层磷脂上.根据脂滴的蛋白质组学研究结果,脂滴的表面蛋白包括结构蛋白、脂类合成酶、脂类水解酶和膜转运蛋白等.脂滴的结构蛋白主要是 PAT 家族蛋白,包括 perilipin[9]、ADRP[10]、TIP47[11]、S3-12[12]和 OXPAT[13].PAT是最初发现的三个蛋白 perilipin、ADRP 和 TIP47 首字母的组合,它们都有一个共同的N端结构域,被称为 PAT 结构域.每一个 PAT 蛋白都有各自的组织分布特异性,除了 TIP47 也分布在其它亚细胞结构中外,PAT 家族蛋白都主要定位在脂滴上.PAT家族蛋白的功能并未完全研究清楚,已发现的功能主要包括维持脂滴的形态、保护中性脂不被水解、调控脂滴的运动等.最近,PAT 家族蛋白又被命名为 perilipins 1-5[14].与脂滴功能密切相关、研究较多的一类脂滴表面蛋白是脂类水解酶,主要包括 HSL(hormone-sensitive lipase)和 ATGL (adipose triglyceride lipase).HSL 在脂肪细胞中含量较为丰富[15],在心肌和骨骼肌组织中也有分布[16,17].HSL 一般存在于胞浆中,但当特异位点的丝氨酸被磷酸化后,会使其活化并由胞浆转运到脂滴表面,行使脂类水解酶的功能[18,19].ATGL 的发现是缘于 HSL 敲除鼠中的脂肪组织含量并未发生变化[20],而甘油二酯(diacylglycerol,DAG)的水平有所上升[21],这就提示,除了HSL,还有其它酶可以水解甘油三酯.2004 年,Liu 等[22]在脂滴蛋白质组中首次发现了该蛋白的存在.Zimmermann 等人[23]发现该蛋白在脂肪组织中表达,并且能够行使脂类水解酶的功能,由此命名它为ATGL；同时,Jenkins 等人[24]也发现了该蛋白作为脂类水解酶的功能.后续研究还发现,ATGL 不仅存在于脂肪组织中,也分布于心肌和骨骼肌中[25～27],并且在物种间非常保守[28～30].近来的研究发现,ATGL 的活性可以被 G0S2[31]和磷酸化[32～34]调控.另外一类与脂滴功能密切相关的脂滴表面蛋白是膜转运蛋白.根据脂滴的蛋白质组学结果,脂滴表面存在着以下几种膜转运蛋白：小G 蛋白 (small GTPases),尤其是 Rabs,调控囊泡的形成和定位；动力蛋白,如 kinesin、dynein 和 myosin,使囊泡沿细胞骨架运动；SNARE蛋白(soluble NSF attachment receptor,SNARE),促使膜融合；囊泡转运蛋白,如Arf1、Sar1、Sec21 和 COPs 等,调控蛋白分选和囊泡形成[7].这些蛋白的存在,在一定程度上证明了脂滴的“运动能力”,提示脂滴有可能像细胞内的囊泡一样移动,识别靶目标后,与其靠近并发生膜融合.事实上,已有研究表明,脂滴确实可以沿着细胞骨架移动[35].上述这三类蛋白在调控脂滴脂质水解及运动方面发挥作用,可能也是脂滴与线粒体发生相互作用的必要物质基础.除了上述的三类蛋白外,脂滴表面还存在着其它功能的蛋白.迄今为止,已完成的脂滴蛋白质组学研究表明,在各个物种的各种细胞的脂滴表面,都发现了线粒体蛋白的存在[22, 36～41].这些蛋白包括与代谢相关的酶类、与电子传递及能量生成相关的蛋白、与运输相关的蛋白、分子伴侣以及与转录相关的蛋白[42].为什么脂滴表面会检测出线粒体蛋白？基于文献报道及本实验室的研究,我们认为有以下几种可能：1)有些蛋白本身就有多种分布,会同时存在于线粒体和脂滴.但由于对脂滴蛋白的研究晚于线粒体蛋白,所以这些蛋白一直被认为是线粒体蛋白.2) 脂滴与线粒体相互作用时会发生蛋白 - 蛋白相互作用,与脂滴蛋白相互作用的线粒体蛋白会留在脂滴表面.3) 脂滴与线粒体相互作用时,会通过某种较强的作用力,使小的线粒体片段结合在脂滴表面,与脂滴一起被纯化出来.这种较强的作用力有可能是强的蛋白 - 蛋白相互作用,也有可能是膜的部分融合.4) 不能完全排除脂滴纯化过程中有线粒体的污染.虽然目前还不能清楚解释究竟是什么原因导致线粒体蛋白出现在脂滴表面,但脂滴的蛋白质组学研究给我们提供了研究脂滴功能的新思路,从一定程度上说明脂滴与线粒体之间存在着密切关系.脂滴与线粒体相互作用的形态学研究在人们使用光学显微镜及电子显微镜观察亚细胞结构时,多次观察到脂滴和线粒体在空间位置上的紧密排布.早在上世纪 80 年代,就在脂肪细胞中发现了围绕在脂滴表面的线粒体[43,44].在肝脏细胞[45]和乳腺细胞[46]中也有类似的发现.荧光能量共振转移实验发现,在猪的卵母细胞中,脂滴与线粒体会相互靠近到 6～10 nm 之内,提示这两个细胞器在功能上的相互联系[47].在分辨率更高的透射电镜下,细胞样品显示脂滴和线粒体会发生直接的接触[48,49].在人肌肉组织中的研究表明,Ⅰ型肌纤 (氧化型肌纤) 中的线粒体和脂滴交替排列成链状[50].脂滴和线粒体之间的相互作用会受到调控.运动后,血液中的脂肪酸水平降低,肌肉细胞中脂滴与线粒体的相互作用就会增加[48].我们在大鼠骨骼肌细胞 L6 中标记了脂滴和线粒体,在激光共聚焦显微镜(confocal microscope)下观察它们的形态,并通过 Z 轴扫描的方式进行三维重构[42].通过对 200 个细胞进行观测统计,我们发现脂滴和线粒体的相互作用与脂滴的大小存在联系：脂滴越大,与线粒体相互接触的可能性就越大.这从一个侧面再次说明,脂滴和线粒体不仅能发生相互作用,而且,这种相互作用还是可以被调控的.脂滴与线粒体相互作用的分子机制和功能探寻脂滴和线粒体是如何相互作用的？哪些蛋白起了关键作用？这些问题到目前为止并没有十分清楚的答案,但脂滴蛋白质组学的结果可以为这方面的研究提供一些线索.如前所述,脂滴表面存在着一类与膜转运相关的蛋白 Rabs.已有研究表明,Rabs 会介导脂滴和内涵体的相互作用[51],Rab18 会使脂滴和内质网相互靠近[52～54].这些结果提示我们,膜转运蛋白也有可能在脂滴和线粒体的相互作用中发挥作用.2009 年,Jagerstrom 等人[55]发现脂滴和线粒体是通过synaptosome associated protein 23 (SNAP23)蛋白进行相互作用的,虽然具体的机制还不清楚,但却为膜转运蛋白介导脂滴与线粒体的相互作用提供了一个证据.另一个参与脂滴与线粒体相互作用的已知蛋白是 Caveolin1.高压冰冻电镜照片显示,在脂肪细胞中,脂滴周围聚集着高电子密度的线粒体,而Caveolin1 敲除后,脂滴周围的线粒体消失了[56].为了找到调控脂滴与线粒体相互作用的蛋白,并且探寻脂滴和线粒体相互作用的细胞功能,我们利用双分子荧光互补检测法( bimolecular fluorescence complementary assay,BiFC)[57],在酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)中,对脂滴表面蛋白与线粒体及过氧化物酶体(酵母中β-氧化发生在过氧化物酶体中)表面蛋白可能存在的相互作用进行了筛选(图 1)[42].在将近 5000 对蛋白中,检测到 116 对蛋白有不同程度的相互作用.其中 75%的信号集中在Erg6和 Pet10 两个蛋白上.另外,我们还发现了 3 对与脂类代谢相关的酶之间的相互作用.Erg6 是在麦角固醇合成过程中起作用的一个酶,Pet10 功能未知.与 Erg6 和Pet10相互作用的蛋白质功能各异,但数量最多的是与运输相关的蛋白质和酶类.根据以前的研究报道,麦角固醇可以调控膜的通透性和流动性,升高的麦角固醇水平还能促进膜的融合[58].Erg6 能与众多的线粒体蛋白发生相互作用,提示麦角固醇对膜的调控和促融合作用,可能在脂滴与线粒体的相互作用中发挥重要作用：Erg6增加了麦角固醇的局部浓度,改变了膜的性质,形成了适合蛋白相互作用的微环境.虽然有关脂滴与线粒体相互作用的功能研究很有限,我们对这方面还知之甚少,但现有的结果已经能给出这样的提示：除了脂肪酸的储存与氧化外,脂滴与线粒体的相互作用,很有可能参与细胞内的其它脂类(如甾醇、磷脂酸等) 代谢过程,通过对代谢中间体的交换和运输来缩短脂类合成和分解步骤,达到更高效完成代谢的目的.脂滴与线粒体相互作用在骨骼肌有氧运动中的作用除了脂肪细胞,肌肉细胞中也会储存少量脂类,被称为 intramyocellular lipids (IMCL).IMCL 主要是以中性脂的形式储存在脂滴中,当细胞需要能量时,脂滴中的甘油三酯会被水解生成脂肪酸,为肌肉中发达的线粒体提供氧化底物.机体有氧运动过程中主要依靠脂肪氧化供能.已有研究表明,有氧运动可以促进骨骼肌细胞线粒体内的脂肪酸氧化作用[59].此外,有氧运动可以促进大脂滴向小脂滴转变,而小脂滴具有更大的比表面积,更利于脂肪酸的水解[60].那么,有氧运动是否可以通过介导骨骼肌内脂滴与线粒体的相互作用而加速脂肪代谢过程呢？Tarnopolsky 等人[48]研究证实,健康人连续 7 周进行每天 90 分钟的 60%最大摄氧量训练,其骨骼肌肌肉活检测试表明：有氧运动在一定程度上增加了细胞内平均脂质面积密度及脂滴数量；线粒体总面积及单个线粒体体积显著提高；脂肪氧化供能比例显著提高；脂肪酸β-氧化限速酶———短链 β 羟酰辅酶 A 脱氢酶,以及三羧酸循环限速酶———柠檬酸合成酶的活性分别显著增加；并且,细胞内脂滴与线粒体的接触数量显著增加.该研究清晰地表明：有氧运动因增加了骨骼肌脂滴数量而提高了肌细胞内脂质的面积；因改变线粒体体积而增加了细胞内线粒体总面积；更重要的是,有氧运动可以改变脂滴的分布特征,增加与线粒体直接接触的脂滴数量,通过促进脂滴与线粒体的相互。