OD260与OD280比值的问题.doc

DNA纯度的判断根据OD260/OD280的比值判断，符合要求纯度高的纯化 DNA 其 OD260/OD280在1.61.8 之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有 RNA一般机器给出的比值是分子分母同时减 OD320所得，你可以自己算一下 OD260/OD280如果在要求的范围内，说明你的OD320偏高,即可能有有机物污染 比如酒精未充分挥发我要纠正一下，纯DNA的A260/A280应大于1.8,纯的RNA应达到2.0，样品中如果含有蛋白质及苯酚， A260/A280 比值会明显下降对于纯 的样品，只要读出260nm的A值即可以算出含量通常以 A值为1相当于50 微克/ml双螺旋DNA,或者40微克/ml单链DNA（ RNA），或者20微克/ml寡 核苷酸计算OD260/ OD2801.92.0 RNA居多纯度已经很高了纯 DNA：OD260/OD28Z1.8（＞1.9，表明有RNA污染；V1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯 RNA：1.7 V OD260/OD28CX2.0（V1.7时表明有蛋白质或酚污染；〉2.0时表明可能有异硫氰酸残存）OD 是 optical den sity （光密度）的缩写，0D= log （1/trans）,其中 trans 为检测物的透光值。

吸光度,absorbanee是指光线通过溶液或某一物质前的入射 光强度与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数,影响它的因素有 溶剂、浓度、温度等等吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关只 要光的波长被固定下来,同一种物质,吸光系数就不变当一束光通过一个吸 光物质（通常为溶液）时,溶质吸收了光能,光的强度减弱吸光度就是用来 衡量光被吸收程度的一个物理量吸光度用A表示，A= abc,其中a为吸光系数，单位L/（g?cm）,b为液层厚 度（通常为比色皿的厚度），单位 cm , c为溶液浓度，单位g/L影响吸光度的 因数是b和ca是与溶质有关的一个常量，温度通过影响 c,而影响A一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代 表其他杂质（多糖等）的吸光度A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的A代表吸光值，而0D是光密度值，一个意思比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准，纯的 DNA 一般在1.8-2.0之间；后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260和A280读数；同时,对同一样品 10倍数量级稀释后测定吸光值发现,分光光度计的吸光值仅 在一定的区域是线性的。

结论是：当 A260 读数处在0.1-0.5之间，A200到A320之间的数值构成一条光滑的曲线时，少量苯酚(30 ul/ml)残留使A230, A260, A280均变大(差不多增加一倍)，但 A260/A280和A260/A230均在2左右少量异硫氰酸胍(132uM)残留使A230变 大，但 A260， A280 几乎不变，所以 A260/A280 仍在 2 左右，而 A260/A230 大 大低于 2大量异硫氰酸胍 (2.4M)残留使A230, A260, A280均变大，根本就没有办法测定了 PEG (6.25%)残留使A230, A260, A280均变大，但对A230, A260影响更大，所 以 A260/A280 比 2 大不少，而 A260/A230 仍在 2 左右核酸抽提中常用的试剂，如 Phenol， Guanidine Isothiocyanate， PEG 都能使 A260和A280的值变大，但是却可能使二者的比值与高纯度核酸的比值一致 因为A260值几乎是峰值，所以有必要在其两边各取一个：A280和A230干净的核酸 A260/A230应该在2左右如果有在 230nm处 的强吸收提示污染有酚盐离子等有机化合物1. 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。

减少起始样品量，确保裂解完全、彻底 加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够如果所得RNA的0D260/0D280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解2. 苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分 层的离心力和时间要足够3. 多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致 OD260/OD280比值偏低因此，从这类材料中提取 RNA时，需要注意多糖、多 酚杂质的去除4. 设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使 OD260读数在0.1-0.5 之间此范围线性最好用水稀释样品：测 OD 值时，对照及样品稀释液请使用 10mMTris，pH7.5用水作为稀释液将导致比值偏低比值低可能有蛋白污染，高了可能有 DNA污染，建议你抽提的RNA分三 管，两管保存，另一管用来跑胶和测定 0D,跑胶是最直观的，1%的胶就可以, 抽提后马上跑，一般不会降解很多，所以设备材料不需要去酶处理不会有影响的你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸可以试着 调到8.0 左右再测，这样就会上来了。