死活细胞的鉴别word版.doc

一）、死活细胞的鉴别生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微镜来观察染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖由于未经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别所用染料的分类：一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染料才能进入细胞膜第一类 ：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料它们不容易穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色②苯胺兰(Aniline’ black)：0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。

①1%结晶紫染色生理1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色属于活细胞染料活细胞染料无毒，无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰，它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在磷酸根上在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNAPage 9发桔红色荧光因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色死亡的细胞，因物质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色但丫啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体二）细胞核和染色体的染色Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质丝的螺旋化等。

该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有丝分裂指数细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即可观察三）细胞器的特殊染色1 / 41、内质网的显示早在 1945 年，有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞的内质网之后，观察内质网基本是采用电子显微镜在 80 年代中开始发展了一些活细胞荧光染料，又称“荧光探针”，为显示细胞内的模型结构，包括内质网，提供了新的途径DiOC6(3):是一种亲脂性的阳离子荧光染料，可选择性的与负电性的膜结构结合在低浓度时仅能染出线粒体，细胞界限不清，较高浓度时（0.5-2.5μg/ml）内质网染色最佳，而容媒体、高尔基体等均然浅色2、高尔基体的显示在光镜下观察高尔基体可用景点的固定染色，也可用活细胞荧光染料由于高尔基参与分泌这一动态过程，对糖蛋白、糖脂进行加工、分选和运输，所以在活细胞中研究其动态和三维结构具有重要的意义Baker 苏丹黑染色法：可用于组织块、体外培养的单层细胞的染色染色结果：高尔基体呈黑色囊泡，细胞核呈红色。

Page 10活细胞中高尔基体染色：用荧光探针 NBD-hexanoic ceramide 进行染色溶酶体的显示：观察溶酶体可以用电子显微镜，也可以采用细胞化学的方法来现实比如，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶这部分内容在下学期讲3、线粒体的显示线粒体（mitochondrin）:是细胞内一个极为重要的细胞器，是细胞内物质氧化磷酸化产生能量的重要结构线粒体的形态结构和功能定位光镜：多为粒状、杆状、线状不同的细胞类型，不同的生理状况，其形态大小也有所不同电镜：是由二层单位膜围成的膜性囊，⑴． 外膜与内膜不连接⑵． 内膜是皱褶的⑶． 内膜表面不光化的膜结构向内凹陷，形成嵴⑷． 嵴上有基体微粒（上面有 ATP 酶，是偶联磷酸化的关键装置）⑸． 嵴间为基质，含蛋白质、脂类、DNA、RNA 和核蛋白体有关催化线粒体内各种生命活大过程所需的酶和辅酶，都分布粒体的基质中细胞生命活动中需要的大约 95%的能量来自线粒体所以说线粒体是一个重要的细胞器细胞的内外环境因素的改变，可引起线粒体结构和功能的异常发现和检查线粒体就显得十分重要了但线粒体在动物死后极易产生变化，故取材必须新鲜 Page 11实验三 健那绿染活细胞线粒体原理：健那绿（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，具有脂溶性，能跨过细胞膜，解离后，有染色能力的基团带正电，结合在负电性的线粒体内膜上。

内膜上的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，呈蓝绿色而在胞质内染料被还原成无色线粒体浸泡在染液中能维持活性数小时，使我们能够直接看到生活状态的线粒体的外形，分布及运动试剂：0.2%Janus green B 0.1g 加温到 30-40℃，充分生理盐水 50ml 溶解需新鲜配置，以保持被氧化的能力）染色：1.培养的细胞或用牙签刮下口腔粘膜上皮细胞；2.涂在干净的载玻片上；2.滴加 0.2%Janus green 液，室温染 10 分钟，盖上盖玻片观察，注意在盖玻片下放两根头发丝，避免细胞被压迫，并可存有较多的液体结果：线粒体呈蓝绿色，细胞质接近无色实验四 过氧化物酶的显示微体:早在 50 年代初有人发现在动物的细胞内存在有一种微小的颗粒，它多见于肝细胞和肾小球上皮细胞内，但也广泛分布在小肠、心肌、骨骼肌、肺、肾上腺、附睾、神经、脊髓、脑等在不同的组织中微体所含的酶也不同，如苹果酸合成酶、过氧化氢酶、天东氨酸氨基转移酶等，过氧化氢酶是微体的标志酶在过氧化氢酶分子中，有两种酶活性，即过氧化氢酶活性和过氧化物酶活性过氧化物酶和过氧化氢酶两者具有相似的化学性质，它们像血红蛋白和肌红蛋白一样，都属于血红蛋白素蛋白，具有相同的辅基，即铁卟啉或血红素。

过氧化氢酶可使过氧化氢分解成水和氧， Page 122H2O2=2H2O+ O2这个分应称为过氧化氢酶反应，过氧化氢酶因有这种分解作用而被划分为分解酶类，也可把它看作是转移酶或岐化酶过氧化物酶对纯过氧化氢没有分解作用，但如果有合适的受体存在，则能催化氧转移到受体上，而使受体被氧化，H2O2+AH2=2H2O+A 这个反应称为过氧化物酶反应过氧化物酶：又称过氧化酶（peroxidase）过氧化物酶是一种氧化还原酶，它除了分布在髓性白细胞外，还广泛的存在于各种组织细胞中它的种类很多，如在牛奶中有乳-过氧化物酶、红细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶、酵母中的细胞色素 c 过氧化物酶等过氧化物酶的功能：是机体中的抗氧化酶，在防止氧代谢物的损伤中具有重要的作用⑴ 过氧化氢对细胞有毒害作用，通过过氧化物酶的作用可清除过氧化氢，防止其在细胞内聚集⑵ 参与肝、肾对有毒物质的解毒⑶ 对细胞的氧张力具有调节作用⑷ 可能参与核酸、脂肪和糖代谢 反应原理:过氧化物酶在分解H2O2的过程中，必须由过氧化物而来的氧进行氧化作用的 在反应中有两种底物，即受氢体与供氢体，前者的代表是过氧化氢，后者的代表是联苯胺类的药过氧化物酶的反应通式如下：AH2（供氢体） +H2O2受氢体= A（供氢体的氧化物）+ 2H2O 过氧化物酶可将底物中的H2O2分解，产生新态氧，使无色的联苯胺蓝氧化为蓝色的联苯胺蓝。

实验： 过氧化物酶的显示原理：同上材料和方法：材料：0.5%硫酸铜、1%联苯胺（含有 30%的H2O2）、0.5%藏红花、玻片、滴管、剪 Page 13子、小鼠操作方法：⑴ 涂片：剪小鼠尾部，取血涂片，晾干备用⑵ 在晾干的涂片上滴一滴 0.5%硫酸铜，染 2 分钟⑶ 倾去硫酸铜，滴加联苯胺冲掉硫酸铜，在加一滴新的联苯胺，染 2-5 分钟⑷ 1%的藏红花复染⑸ 流水冲洗，晾干、镜下观察结果：粒细胞的过氧化物酶反应阳性，呈蓝色颗粒，细胞质为红色临床意义：主要用于定性、定位观察急性白血病及其鉴别诊断在正常血骨髓中：过氧化物酶阳性的主要是中性粒细胞中性粒细胞：原粒时 POX 为阴性，早幼粒时开始出现阳性反应，以后逐渐反应增强嗜酸性粒细胞：P0X 可成团块状嗜碱性粒细胞：反应多为阴性单核细胞：阳性反应颗粒多为细小弥散病理：在急粒、慢粒时 POX 增强，在急单时 POX 减弱而在急性淋巴型白血病时，POX 是阴性，因此可以与急性粒细胞性白血病和单核细胞型白血病进行鉴别在慢性粒细胞性白血病中嗜碱性粒细胞的 POX 反应呈阳性反应 （注：本资料素材和资料部分来自网络，仅供参考请预览后才下载，期待您的好评与关注！）。