结核分枝杆菌耐药机制研究进展.doc

1结核分枝杆菌耐药机制研究进展【关键词】 结核分枝杆菌 ; 基因; 突变 ; 耐药性结核病是严重危害人民身体健康的传染性疾病耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌(MDR-TB)的出现和传播是导致结核病发病率升高的重要原因结核杆菌无法通过质粒的介导从其他细菌获得耐药性，因此染色体介导的耐药是结核杆菌产生耐药的分子基础目前对结核杆菌耐药机制的研究主要集中在药物作用靶位及相关基因的突变上现就结核杆菌对主要的抗结核药物的耐药机制的研究进展做一综述1 异烟肼(INH)有研究表明，结核杆菌耐 INH 涉及多个基因变化：katG，inhA，kasA，ndh 及 oxyR-ahpC 基因连接区1. 1 katG 基因 即过氧化氢酶一过氧化物酶(catalase-peoxidase)的编码基因异烟肼被结核杆菌内的过氧化氢酶-过氧化物酶活化，活化产物作用于 enoyl-ACP 还原酶(属于脂酸合成酶 II系统，可促进短链脂肪酸合成脂酸),抑制杆菌酸和细胞壁生物合成katG 基因的上游相隔 44 个碱基与 furA 基因 (一种结核杆菌铁调控2蛋白编码基因,可能为 katG 基因的启动子, 并调控其表达) 相连，下游相隔 2794 个碱基与 embC 基因相连，全长 2223 个核苷酸。

引起INH 耐药性的主要原因是 katG 基因的点突变、缺失、插入，完全缺失仅占 INH 耐药菌株的 7%～24%katG 基因常见的点突变是315 位 AGC→ACC 和 463 位 CGG→CTGkatG 基因 315 位突变通常会造成过氧化氢一氧化物酶活性的降低,造成中等水平到高水平的耐药[1]Coll 等[2]对 6l 株异烟肼耐药株进行分析，其中 55%分离株检测到 katG 基因突变，最常见的变异是第 315 位密码子(占32%)，这些菌株显示了高水平的耐药此外还可见 katG 基因104、 108、 138、148 位等突变各基因序列改变的具体位点与katG 酶的活性以及 INH 耐药性的关系还有待进一步的研究1. 2 inhA 基因 即烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH) 依赖的enoyl-ACP 还原酶的编码基因活化的 INH(异烟碱酰基)与 inhA酶(enoyl-ACP 还原酶) 活性部位的辅因子 NAD 结合，生成高亲和力的共价化合物，而削弱了 NADH 和 enoyl-ACP 还原酶的亲和力，干扰了脂酸的合成，进而发挥抗菌作用inhA 基因突变约占异烟肼临床耐药株的 10%-35%[4] 。

耐药的发生可由于 inhA 结构基因突变造成 INH 与 NADH 的亲和力下降，或是 inhA 启动子-15 的C→T 的点突变[3]以及 inhA 调节序列突变可能创造一个强有力的启动，使 inhA 蛋白过度表达从而提高对 INH 活性形式所需的浓度，引起对 INH 耐药[5] inhA 基因的突变伴随低水平 INH 耐药性，和3katG 基因不同，katG 突变后耐药水平的高低取决于突变对过氧化氢一过氧化物酶活性的影响，突变导致酶活性完全丧失可引起高度INH 耐药InhA 的突变不仅引起 INH 耐药，还会引起结构相近的二线抗结核药物乙硫异烟(ETH) 的耐药性[6]1. 3 oxyR-ahpC oxyR 基因表达的蛋白是氧压的感应器又是基因转录的活化剂,参与调节 katG 和 ahpC 基因(编码烷基过氧化氢还原酶,参与氧化 -应激应答[7])的表达而结核杆菌的 oxyR 基因发生大量移码突变和缺失，没有活性，当 Deretic[8]等用突变体与携带具有活性的 oxyR-ahpC 基因的质粒组成一个重组体，结果对异烟肼耐药，因此 MTB 对 INH 敏感可能是由于 oxyR 基因的异常化。

同时 Dhandayuthapani[9]等发现部分 katG 突变的耐异烟肼分离株存在 ahpC 启动子(存在于 oxyR-ahpC 区)突变，增强 ahpC 表达来补偿过氧化氢酶一过氧化物酶的缺乏，从而抵抗宿主巨噬细胞的氧化因此可将 ahpC 突变作为 katG 基因变异的标志，但二者不是一种简单直接的因果关系[10]1. 4 kasA 和 ndh kasA 基因编码 β-酮酰基载体蛋白合成酶，参与分枝菌酸生物合成，是 INH 耐药的另一个相关基因，全长1251bp，编码 471 个氨基酸，其中最常见的突变是第 312 位点但在大约 19%敏感株中也发现同样突变，推断该基因在异烟肼耐药中表现为多态性[11] katG、inhA、ahpC、oxyR 和 kasA 基因突4变并不能解释所有的异烟肼耐药问题lee[12]等报道了一个与结核杆菌对异烟肼耐药有关的基因 ndh,即编码 NADH 脱氢酶基因，ndh 基因的突变使 NADH 脱氢酶活性受到抑制，使 NADH/NAD 比率升高，抑制 INH 的过氧化，也阻止异烟酰乙酸 NADH 与 InhA酶的结合，从而使细菌产生耐药性，具体机制还有待进一步研究。

2 利福平利福平作用于结核杆菌 DNA 依赖的 RNA 聚合酶亚基 β 亚单位，从而抑制 mRNA 的转录rpoB 基因是结核杆菌 DNA 依赖RNA 聚合酶 β 亚单位的编码基因，全长 3543 个碱基.当其中长 81个碱基的核心区域-- 耐利福平决定区(RRDR) 发生突变时，包括点突变或短的插入、缺失突变等，使 DNA 依赖性 RNA 聚合酶 B 亚单位酶结构改变，利福平不能与细菌 RNA 聚合酶 β 亚单位结合而表现为耐药在结核杆菌 DNA 依赖的 RNA 聚合酶亚基 β 亚单位氨基酸序列中有 3 个短区域与耐利福平相关： 507aa-534aa、567aa-574aa、687aa[13] 95%左右的 RFP 耐药菌株的基因突变都集中在 507～533 位的 27 个氨基酸(81bp) 组成的区域，这一突变区被称为利福平耐药决定区(rifampicin resistance determing region，RRDR)其中以编码 531 位氨基酸的碱基 TCG→TTG 的和编码 526 位氨基酸的碱基 CAC→TAC 的突变最常见，因此这个区域的突变可作为一种检测结核杆菌耐 RFP 简易、快速的方法。

在5临床分离的 MDR-MTB 中，86%的耐药株有 rpoB 基因的突变，因此认为 rpoB 基因的突变是 MDR-MTB 菌株的标志已知 RFP 耐药菌的 rpoB 基因有 14 种突变，其中 9 种突变对利福布丁和利福喷丁交叉耐药531、526 位点突变株对所有利福霉素类药物均高度耐药3 氨基糖苷类氨基糖苷类主要作用于结核杆菌的核糖体，抑制蛋白质合成耐链霉素(SM)的结核杆菌，其编码核糖体 16 SrRNA 的 rrs 基因与编码核糖体蛋白 S12 的 rpsL 基因发生突变，降低药物结合到核糖体上的能力，使之对 SM 耐药[14]rpsL 基因突变是链霉素耐药的主要机制,编码第 43 位氨基酸的碱基 A→G 的突变，是最常见的突变位点[15] rrs 基因突变点为 512、513 位的碱基插入，这些位置的碱基发生突变可导致高水平的耐药，rrs 基因突变主要集中于 530环区和 915 区，此两区均为 16SrRNA 和 S12 蛋白结合并相互作用的场所耐丁胺卡那(AK)和卡那霉素的结核杆菌中，rrS 基因突变率为 67. 4%，最常见的突变是 1401 位点 A→G 单碱基置换(60. 5%)，少数分离株为(1402 位 )C→T 或 A、(1484 位)G→T，这些突变主要发生于高水平耐药株，32. 6%的耐卡那霉素分离株未发现 rrS 基因突变，可能还存在其他耐药机制。

卷曲霉素(CPM)和紫霉素(VIO)在6结构上相似,结核杆菌对 CPM 和 VIO 耐药是由于 tlyA 基因(编码rRNA 修饰酶 2’-O -甲基转移酶) 和 rrS 基因突变所致，其中 tlyA基因突变是耐药性产生的重要原因卷曲霉素、紫霉素、卡那霉素和 AK 之间存在交叉耐药性[16]4 吡嗪酰胺吡嗪酰胺(PZA)在细胞内酸性环境中经吡嗪酰胺酶作用转变成吡嗪酸而起杀菌作用编码吡嗪酰胺酶的 pncA 基因突变致使酶活性丢失是其主要的耐药机制pncA 基因全长 561bp，其突变分布在启动子区域和结构基因的各个位置Hou 等报道耐药结核菌的pncA 基因有 54 位、 118 位、368 位、501 位的点突变，起始密码有一 8bp 丢失，88 位 ser→终止密码子等突变，而 Park 等报道在起始密码子一 11 上游区 A 与 G 点突变是最常见的类型，Endoh 等[17]报道在 382 位有一 8bp 丢失，另见 29 位、11 位突变还有一些在 102 位发现无义突变(C→G)但在敏感菌株中也发现了一些pncA 基因突变，如第 6 位 G 和第 300 位 CT 的沉寂突变[18]。

pncA 基因突变的特点不一，是否与地理区域有关，尚需进一步探讨另 28%的 PZA 耐药菌的耐药机制仍在研究中，如吡嗪酸在菌体的转移等[19] 5 乙胺丁醇(EMB)7EMB 主要作用于阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影响细胞壁分枝菌酸一阿拉伯半乳聚糖一肽聚糖复合物的形成当阿拉伯糖基转移酶编码基因(emb)的操纵子突变致氨基酸替换，可改变药物与酶的相互作用而导致耐药该操纵子由 embA、 embB 和 embC 三个基因组成，其中 embB 基因，编码一个糖基转移酶，embB 基因突变导致糖基转移酶结构改变，影响了 EMB 和糖基转移酶的结合而产生耐药，其中第 306 位密码子的错义突变最为常见[20]，该位点密码子突变具有相当的普遍性，可用于快速测定耐乙胺丁醇菌株embC 基因 394 位密码子和 738位密码子的突变、embA 中 462 位密码子、913 位密码子等以及位于 embC-embA 之间的区域内的第 1 位、l2 位和 l6 位密码子的突变均被检测到，但这些突变与耐药性之间的确切关系还要做进一步研究 [21]6 氟喹诺酮类药氟喹诺酮类药物(FQ)是复治病例主要的抗结核药物之一，其作用靶位是结核杆菌的 DNA 旋转酶，DNA 旋转酶由 gyrA 和 gyrB两种基因编码的两个 A 亚单位和两个 B 亚单位组成。

FQ 主要作用gyrA 基因编码的 A 亚基，可以抑制细菌染色体的 DNA 复制，而编码的 gyrA 基因发生突变则导致药物结合位点构象改变，以致产生8耐药性喹诺酮类耐药结核菌中，突变大多发生在 gyrA 基因保守区 67～106 位的密码子区,常见有 94 位 GAC→GCC 或 CAC 或TAC， 90 位 GCC→GTG 的突变[22] gyrA 基因突变与药物浓度和结构有关，gyrB 基因突变可能改变了胞内药物的蓄积,而呈现低度耐药7 大环内酯类药物大环内酯类药物作用于 50S 核蛋白体亚单位上，抑制细菌蛋白合成及核肽链的延伸而发挥抗菌作用耐药结核杆菌染色体存在erm 基因，其编码产生的酶能将核蛋白体亚基的 23SrRNA 上一个特异性腺嘌呤残基 N6 位甲基化，改变了核糖体构象，降低了细菌与大环内酯类的亲和力[23]结核分枝杆菌 H37Rv 的 Tap 基因(Rv1258)编码结核分枝杆菌的膜外排泵，约有 12 个跨膜区域和不同的基序特征，可能与大环内酯类抗生素耐药机制相关8 乙硫异烟胺及环丝氨酸乙硫异烟胺可在结核杆菌内诱导产生 4 一烟醇产物，能抑制合成结核菌酸必需的结核菌酸合成酶。

现已证实结核分枝杆菌基因ethA 和 ethR 与乙硫异烟胺耐药有关： ethA 编码的蛋白属于含黄9素单氧化酶家族，催化激活乙硫异烟胺;ethR 基因编码的阻抑物属于转录调节器 TetR/CamR 家族.负性调节 ethA 的表达[24]inhA。