不同产地广藿香的挥发油主成分分析及其遗传多态性的RAPD分析.docx

不同产地广藿香的挥发油主成分分析及其遗传多态性的RAPD分析广藿香是唇形科刺蕊草属植物,作为重要的药材和香料,具有芳香化湿、和胃止呕、祛暑解表的功效,成方制剂有藿香正气水、霍胆丸等[1]藿香正气水作为《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第六版)》中医治疗中推荐的中成药,其主药藿香[2,3]多指广藿香,产于广东、海南、台湾等现代药效学研究表明,挥发油是广藿香的主要活性成分,具有抑菌[4,5]、抗真菌[6]、抗氧化[7]、免疫调节[8]等作用,广藿香醇是广藿香挥发油的质量控制指标[9]不同产地的广藿香挥发油的成分存在一定差异,如何进行质量控制和客观评价值得关注为有效控制广藿香挥发油的品质和明确地域特征,作者采用GC-MS方法对不同产地广藿香挥发油化学成分进行定性和定量分析,运用SIMCA+P统计软件进行主成分分析,采用随机扩增多态性DNA技术对不同产地广藿香的多态性和品种亲缘关系进行分析,探究不同产地广藿香挥发油含量和种质资源的分子学差异1、实验1.1材料、试剂与仪器广藿香,2017年7月分别采自云南曲靖县、广东化州市,经新疆医科大学中药鉴定教研室徐海燕副教授鉴定均为唇形科刺蕊草属植物广藿香的干燥地上部分。

C7～C40正构烷烃混合标准品(CDGG-110219-06),美国o2si公司;无水硫酸钠(分析纯),天津永晟精细化工有限公司;正己烷(优级纯),天津大茂化学试剂厂Agilent7890A-5975C型气相色谱-质谱联用仪;索氏提取器;FA2004N型电子天平,常州幸运电子设备有限公司;KDM型可调控温电热套,山东鄄城华鲁电热仪器有限公司1.2广藿香挥发油的提取将干燥的广藿香全草粉碎,过60目筛;称取广藿香粉末约50g,置于1000mL烧瓶中,加500mL水和数粒玻璃珠,振摇混合;采用水蒸气蒸馏法提取,直至观察挥发油的含量不再增加为止;停止加热,静置冷却,收集挥发油,无水硫酸钠干燥,称重,计算挥发油提取率,密封保存于4℃冰箱中,备用1.3广藿香挥发油的化学成分分析采用GC-MS联用技术,通过保留时间和对应的内部标准物(C8～C17)的比对,对挥发油的化学成分和色谱峰进行鉴定在国际统一的实验条件下,采用NIST14.L标准质谱谱库,对每个色谱峰对应的质谱进行检索得到其化学结构色谱条件:色谱柱为HP-5MS毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm),载气为高纯氦气,起始柱温50℃,以5℃·min-1的速率升温至300℃并保持20min,进样量1μL,分流比50∶1。

质谱条件:使用EI电离源,电离能量70eV,离子源发生器温度230℃,进样口温度300℃,辅助加热器温度280℃,扫描范围40～800amu,溶剂延迟3min1.3.1定性分析通过比较各物质的质谱与NIST14.L标准质谱谱库中相应物质的质谱的相似度匹配程度,结合正构烷烃标准物质的色谱程序升温保留指数,计算广藿香挥发油中各成分的保留指数,对挥发油化学成分进行定性分析1.3.2定量分析采用峰面积归一化法,计算广藿香挥发油中各化学成分的相对含量(%),对挥发油化学成分进行定量分析1.4广藿香的RAPD分析1.4.1引物的筛选基于相关文献[10,11,12,13],随机选择25个稳定性好、条带清晰的引物进行RAPD分析,分别是:S224、OPB11、OD603、S43、S208、S351、OPD08、OPD10、OPD07、S358、S359、S443、OPG19、S227、OPD13、OPB04、OPD70、OPD19、S42、OPA04、S202、OPD02、OPD18、OPD10、OPA071.4.2DNA的提取取广藿香干重组织约60mg,加入液氮充分研磨成粉末,迅速置于装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入疏基乙醇,使其终浓度为0.1%),迅速颠倒混匀后于65℃水浴20min,期间颠倒离心管数次以充分混合。

加入700μL氯仿,充分混匀,于12000r·min-1(约13400×g,下同)离心5min小心地将上层水相转入一个新的离心管中,加入700μL缓冲液GP2,充分混匀,转入吸附柱CB3中,于12000r·min-1离心30s,弃掉废液向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前先检查是否已加入无水乙醇),于12000r·min-1离心30s,弃掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前先检查是否已加入无水乙醇),于12000r·min-1离心30s,弃掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中重复上一步操作,将吸附柱CB3放回收集管中,于12000r·min-1离心2min,弃掉废液将吸附柱CB3于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加70μL洗脱缓冲液TE,室温放置2～5min,于12000r·min-1离心2min,将溶液收集到离心管中,即得广藿香DNA1.4.3DNA纯度检测通过微量核酸测定仪测定不同产地广藿香的DNA纯度,结果见表11.4.4PCR反应1.4.4.1PCR体系的配制反应体系:2×TaqPCRMix10μL,ddH2O7μL,引物1μL,广藿香DNA2μL。

反应条件:88℃预变性3min;94℃变性1min,38℃退火90s,72℃延伸90s,35个循环;72℃保温10min表1不同产地广藿香的DNA纯度1.4.4.2琼脂糖凝胶的配制称取0.6g琼脂糖,溶于40mL1×1TBE电泳缓冲液中,微波加热2min,边加热边混匀直至透明,室温静置10min,加入2μL核酸染料,倒胶,待其在室温下凝固,即得1.4.4.3电泳点样取扩增后的产物6μL点于凝胶电泳孔中,在78V、65mA条件下电泳60min,电泳结束后,在凝胶成像仪下观察,拍照1.4.4.4数据处理利用RAPD技术对数据进行处理凝胶电泳图谱中的条带代表一个分子标记,代表一个引物结合位点;迁移率相同的条带作为同源条带,有带(显性)记为1,无带(隐性)记为0,强带和弱带都记为1;多态位点仅对在重复实验中能稳定出现的差异带进行数据分析2、结果与讨论2.1广藿香挥发油的化学成分分析采用GC-MS方法,得到不同产地(云南、广东)广藿香的挥发油总离子流图,如图1所示图1不同产地(云南、广东)广藿香的挥发油总离子流图由图1可以看出,云南广藿香和广东广藿香的挥发油成分均得到很好的分离,分离时间适中,峰形良好。

利用NIST14.L标准质谱谱库结合保留指数法、峰面积归一化法对分离的挥发油化学成分进行鉴别归属并测定其相对含量,结果见表2表2不同产地广藿香挥发油的化学成分及其相对含量由表2可知,从云南广藿香挥发油中分析鉴定出了48种化学成分,占总挥发油的99.93%;从广东广藿香挥发油中分析鉴定出了33种化学成分,占总挥发油的99.96%云南广藿香挥发油中相对含量在5%以上的化学成分依次是:百秋李醇(28.53%)、苍术素(11.34%)、反式石竹烯(9.81%)、(+)-喇叭烯(8.81%)、α-杜松醇(7.78%)、甲基丁香酚(6.00%)、白菖烯(5.77%),其主要成分是百秋李醇、苍术素、反式石竹烯;根据化合物分类,云南广藿香挥发油化学成分中单萜0.08%、倍半萜88.17%、含氧倍半萜2.94%、芳香族7.53%、其它1.21%,主要是倍半萜和芳香族类化合物广东广藿香挥发油中相对含量在5%以上的化学成分依次是:百秋李醇(42.28%)、苍术素(10.59%)、反式石竹烯(8.08%)、(+)-喇叭烯(6.92%)、石竹素(6.07%),其主要成分是百秋李醇、苍术素、反式石竹烯;根据化合物分类,广东广藿香挥发油化学成分中单萜0.11%、倍半萜85.27%、含氧倍半萜10.20%、芳香族4.35%、其它0.03%,主要是倍半萜和含氧倍半萜类化合物。

云南和广东的广藿香挥发油有30个共同成分,其主要成分均为百秋李醇、苍术素、反式石竹烯百秋李醇具有钙离子拮抗、促进肠胃吸收和抗菌等药理作用《中华人民共和国药典》(2015年版)中广藿香挥发油以百秋李醇作为质量控制指标,含量不得低于26%[9],据此可判定,云南和广东的广藿香挥发油均达到质量要求,但两者的百秋李醇含量差异较明显,云南广藿香挥发油中百秋李醇含量为28.53%,广东的为42.28%,相差13.75%以百秋李醇含量为评估指标,广东广藿香挥发油要优于云南广藿香挥发油本研究结果与其它研究结果存在差异:熊耀坤等[14]报道,广藿香挥发油中百秋李醇(广藿香醇)含量为19.43%,广藿香酮含量为37.79%;蒲秀峰等[15]报道,广藿香挥发油中百秋李醇最高含量为60.36%2.2广藿香挥发油的主成分分析运用SIMCA+P统计软件对云南和广东的广藿香挥发油的化学成分相关数据进行主成分分析,得到不同产地广藿香挥发油主成分分析载荷图及得分图,如图2所示图2不同产地广藿香挥发油主成分分析载荷图(a)及得分图(b)载荷图显示了不同产地广藿香挥发油的化学成分在X轴方向和Y轴方向上的差别由图2a可以看出,云南广藿香挥发油化学成分分布于2、3象限内,广东广藿香挥发油化学成分分布于1、4象限内,且未交叉重叠。

说明云南和广东的广藿香挥发油的化学成分确实有明显的差异得分图显示了不同产地广藿香挥发油的化学成分在各象限的分布情况由图2b可以看出,两个产地广藿香挥发油化学成分具有差异性:18种成分在广东广藿香挥发油中含量较高,即在得分图中1、4象限的是广东广藿香挥发油的差异性成分,而2、3象限属于云南广藿香挥发油的差异性成分同时,主成分分析得到第一主成分占65.5%,第二主成分占17.4%,累计贡献值为82.9%,可说明大部分的成分数据2.3广藿香的RAPD分析基于前期研究,对25个随机引物进行筛选分别以25个随机引物对不同产地广藿香基因组进行RAPD扩增,扩增产物进行凝胶电泳分析结果发现,25个随机引物均能扩增出条带,一共得到286条条带:云南广藿香扩增得到134条条带,广东广藿香扩增得到152条条带扩增条带数最少的引物是S208、OPD07、OPD13、OPD19、OPD70,分别为3条;扩增条带数最多的引物是OPD19,为10条每个引物能扩增的多态性DNA片段为3～10条,平均可扩增5.72条从25个随机引物中筛选出能够反映不同产地(云南、广东)广藿香多态性差异的特异性引物共6个,分别是:OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07,其RAPD扩增产物的电泳图谱如图3所示。

图36个特异性引物的广藿香基因组RAPD扩增产物的电泳图谱2.4讨论采用GC-MS联用技术,测定不同产地广藿香挥发油的化学成分,发现云南和广东的广藿香挥发油中的百秋李醇含量差异较明显,云南广藿香挥发油中百秋李醇含量为28.53%,广东的为42.28%,相差13.75%云南和广东广藿香的品种亲缘关系较近,获得了6个特异性RAPD引物:OPB11、S227、OPD13、OPD70、OPD19、OPA07,为广藿香提供了分子学鉴定的依据RAPD技术是评估不同产地广藿香遗传多样性的一个可靠有效的方法根据RAPD分子标记多态性,可以估测不同产地广藿香品种之间的遗传关系RAPD扩增快速、简易、灵敏,而且具有多态性,技术成熟,经济可行,可以快速进行分子学鉴定,为现有广藿香的优良种质资源研究奠定基础,有利于广藿香资源的鉴别和合理开发应用关于化学成分、分子学遗传的差异所引起的药效不同有待于进一步研究,也可考虑根据不同产地广藿香挥发油的主要成分及其对应的药理作用,进行广藿香的开发应用,促进中药资源的。