5目的基因转化及筛选.doc

 第五章(1)目的基因导入受体细胞 第一节  受体细胞 外源基因与载体在体外连接重组后形成重组DNA分子，该重组分子必须导入适宜的细胞中方能使外源基因得以大量扩增或表达在基因工程飞速发展的今天，原核细胞和真核细胞都可以作为基因工程的受体细胞，选择适宜的受体细胞也已成为重组基因高效克隆或表达的基本前提之一受体细胞（receptor cell）又称宿主细胞（host cell），从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞显然，并不是所有的细胞都可用作受体细胞一般来说，受体细胞的选择就符合以下基本条件：①便于重组DNA分子的导入②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中③便于重组体的筛选④遗传稳定性高，便于扩大培养或发酵生产对动物细胞而言，受体细胞应对培养条件有较强的适应性，可以在无血清培养基中进行贴壁或悬浮培养⑤安全性高，无致病性，不会对环境造成污染⑥具有较好的转译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达⑦在理论研究和生产实践上有较高的应用价值⑧选用内湖内源性蛋白酶基因缺失的细胞或蛋白酶含量低的细胞在实际应用中，可根据需要重点考虑其中的部分要求。

基因工程中常用的受体细胞如下:一、原核生物细胞原核细胞是较为理想的受体细胞类型，这是因为：①大部分的原核细胞没有纤维素组成的细胞壁，便于外源DNA分子的进入；②没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体重组减少了麻烦；③基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行遗传分析；④原核生物多数为单核细胞生物，培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快因此，原核细胞广泛作为基因工程的受体细胞但是，经原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷，许多真核基因不能在原核细胞如大肠杆菌中表达出有生物活性的功能蛋白质原因是：①原核生物细胞不具备真核生物细胞的蛋白质折叠复性系统，表达出蛋白产物往往是无特异性空间结构的多肽链；②原核细胞缺乏真核细胞的蛋白质加工修饰系统，不能进行多肽的糖基化、磷酸化等；③原核细胞内的蛋白酶易降解空间构型不正确的异源蛋白，造成表达产物不稳定这些缺陷制约了原核细胞作为生物反应器进行异源真核蛋白的大规模生产    至今被用作受体菌的原核生物有大肠杆菌、枯草杆菌、蓝细菌等1．大肠杆菌作为受体菌大肠杆菌是基因工程中发展最为完善和成熟的载体受体系统。

大肠杆菌是革兰氏阴性菌，一些菌株的染色体DNA已经测序完毕，大部分基因的功能已被鉴定目前已经实现商品化的多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌工程菌生产的，如人胰岛素、生长素、干扰素等但是，大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，可导致人体热原反应2.枯草杆菌作为受体菌又称为枯草芽孢杆菌，是一类革兰氏阳性杆菌，作为基因工程受体菌的最大优点是除具有大肠杆菌的优点外，还具有：①枯草杆菌具有胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物高效分泌到培养基中，大大简化了表达产物的提取和架式处理等，而且在大多数情况下，真核生物的异源重组蛋白在分泌后便具有了天然构象和生物活性②不产生内毒素，无致病性，是一种安全的基因工程菌③具有芽孢形成能力，易于保存和培养现已成功地利用枯草杆菌表达了人的b-干扰素、白细胞介素、乙肝病毒核心抗原等3．蓝细菌作为受体菌蓝细菌，也称为蓝藻，作为基因工程受体细胞的最大优点是：①蓝藻是一类光能自养微生物，培养简便，营养条件要求低，可用于大规模生产②由于密码子的偏向性和启动子的通用性，某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主二、真菌细胞    真菌是低等真核生物在基因工程中常用的真菌受体细胞有酵母菌细胞等。

酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖进行无性繁殖的单细胞真核微生物，分属于子囊菌纲（子囊菌酵母）、担子菌纲（担子菌酵母）和半知菌类（半知菌酵母），共由56个属和500多个种组成如果说大肠杆菌是外源基因表达最成熟的原核生物系统，则酵母菌是外源基因最理想的真核生物表达系统作为一个真核生物表达系统，酵母菌的优势是：（1）基因表达调控机理比较清楚，并且遗传操作相对较为简单；（2）具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；（3）不含有特异性的病毒，不产生毒素，有些酵母菌属（如酿酒酵母等）在食品工业中有着几百年的应用历史，属于安全型基因工程受体系统；（4）大规模发酵工艺简单，成本低廉；（5）能将外源基因表达产物分泌至培养基中；（6）酵母菌是最简单的真核生物，利用酵母菌表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系因此，酵母菌的基因工程具有极为重要的经济意义和学术价值三、植物细胞广泛应用于微生物系统的重组DNA技术在高等植物尤其是农作物的品种改良方面也日益显示出其重大的经济意义将相关的单一基因或小型基因蔟导入植物体内，可培育出具有抗病虫害、抗除草剂和抗环境压力等多种优良遗传品质的农作物。

目前大量的农作物转基因品种已经问世，其中包括水稻、玉米、马铃薯、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、亚麻、甜菜、甘草、番茄、生菜、胡萝卜、卷心菜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果和葡萄等不久的将来，人们在超市的货架上还可看到自然界不存在的全新转基因蔬菜和水果高等植物转基因技术的建立迎来了又一次伟大的绿色革命许多高等植物具有自我授精的遗传特性，通常能产生大量的后代，而且借助于如风、重力和昆虫等自然条件，授精范围广、速度快、效率高，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察植物在机械损伤后，会在伤口处长出一块称为愈伤组织的软组织如果取下一小片鲜嫩的愈伤组织，放在含有合适营养成份和植物生长激素的培养基中，愈伤细胞便能持续生长和有效分裂将这种无性繁殖的细胞悬浮液涂布在特殊的固体培养基上，新长出的幼芽则可重新分化成为根、茎、叶，最终再生出整株开花植物愈伤组织的细胞分化取决于植物生长激素各组份的相对浓度，包括生长素（Auxins）和分裂素（Cytokinins）较高的生长素与分裂素之比有利于根部发育；反之则茎部发育植物细胞具有以纤维素为主要构成成份的细胞壁，因而通常不能直接吸收外源DNA。

用纤维素酶处理植物细胞，制备原生质体，后者则可有效接纳重组DNA分子，而且经细胞壁再生后的植物细胞亦可经愈伤组织的形式形成整株植物但这项技术也有一定的局限性，即大多数单子叶植物（如谷类农作物）的原生质体很难再生上述特性为利用植物转基因技术生产具有重要经济价值的重组异源蛋白、改良植物尤其是农作物的品质提供了有利条件然而，许多高等植物拥有比人类更大的基因组，且多以多倍体的形式存在大约三分之二的禾本科植物基因组为多倍体，如马铃薯类植物的细胞染色体数目从24至144不等这种多倍体植物在组织培养中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异，因此由多倍体单细胞再生的植物通常不具有遗传杂合性 四、动物细胞    早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚胎细胞为基因转移的受体细胞，由此培育出一定数量的转基因动物近年来通过体细胞培养，获得了多种克隆动物目前用作转基因的受体动物有猪、牛、羊、魚等经济动物和鼠、猴等实验动物常用的动物受体细胞有小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细、中国仓鼠卵巢细胞（CHO）等以动物细胞，尤其是以哺乳动物细胞作为受体细胞的优点是：①能识别和除去外源真核基因中的内含子,剪接加工成成熟的mRNA。

②真核基因的表达产物蛋白在翻译后能被正确加工和修饰，产物具有较好的免疫原性，约为酵母细胞的16-20倍③易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性和可重复性④可将产物分泌到培养基中，便于提取和加工，成七低缺点是动物细胞培养技术要求高，成功地筛选转化子细胞周期长第二节  DNA的体外重组（切与接）       分子克隆的第一步是从不同来源的DNA（染色体DNA或DNA重组分子）上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时打开载体DNA分子，然后将两者连接成杂合分子有时在外源DNA片段与载体分子拼接前，还需要对连接位点作特殊的技术处理，以提高连接效率所有这些操作均由一系列功能各异的工具酶来完成，其中一些常用的工具酶本身也已使用基因工程方法产生，如部分的限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶以及Klenow DNA聚合酶等 一、限制性核酸内切酶的切割反应       绝大多数II类限制性核酸内切酶对基本缓冲系统的组成要求相同，包括10-50mM（最终浓度，下同）的Tris-HCl（pH 7.5）、10mM的MgCl2、1mM的DTT（二巯基苏糖醇，用于稳定酶的空间结构），唯一的区别是各种酶对盐（NaCl）浓度的需求不同。

据此，可将所有的II类酶分为三大组，即低盐组（0-50mM NaCl）、中盐组（50-100mM NaCl）和高盐组（100-150mM NaCl）盐浓度过高或过低均大幅度影响酶的活性，最多可降低活性十倍在对同一种DNA分子进行双酶切时，如果两种酶对盐浓度要求相同，原则上可以将这两种酶同时加入反应体系中进行同步酶切；对于盐浓度要求差别不大的两种酶，比如一种酶属于中盐组，另一种酶属于高盐组，一般也可以同时进行反应，只是选择对价格较贵的酶有利的盐浓度，而另一种酶可通过加大用酶量的方法来弥补因用盐浓度不合适所造成的活性损失；对盐浓度要求差别较大的（如一个高盐，另一个低盐），一般不宜同时进行酶切反应理想的操作方法是：（1）低盐组的酶先切，然后加热灭活该酶，向反应系统中补加NaCl至合适的最终浓度，再用高盐组的酶进行切割反应；（2）一种酶反应结束后，加入0.1倍体积的5M KAc溶液（pH 5.5）和两倍体积的冰冻乙醇，20℃放置15分钟，于4℃高速离心15分钟，干燥，重新加入另一种酶的缓冲液，再进行第二种酶切反应在某些情况下，两种酶不能同时进行酶切反应，必须先后进行，而且先后次序对酶切效果也相当关键。

这种情况多发生在两种酶的识别序列互相重叠的DNA底物上，如pUC18多克隆位点中的KpnI与SmaI识别序列共用两个GC碱基对，若选用SmaI酶切开pUC18分子，则这个线型DNA分子仍能被KpnI酶解；但若先用KpnI切开pUC18分子，得到的DNA线型分子中的SmaI识别序列已遭破坏，因而SmaI不能进一步切割这种底物当两种酶同时切割时（两种酶同属低盐组），由于作用次序的随机性，导致有些产物分子含有两种酶的酶解末端，而另一些产物分子只有KpnI酶的酶解末端       II类限制性核酸内切酶虽然具有特异性的识别序列及切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性（Star Activity）如EcoRI在正常条件下识别5’GAATTC3’序列，但在底盐（＜50mM）、高pH（＞8）和甘油大量存在的情况下，其识别序列除原来的序列以外，还包括5’AAATTC3’和5’GAGTTC3’等，导致EcoRI在DNA分子上的切割频率大大增加能产生星号活性的限制性核酸内切酶还包括BamHI等，在涉及上述两种酶的多酶联合酶解反应的设计时，应充分考虑这一点。

       限制性核酸内切酶的反应规模设计主要取决于待酶切DNA的量，由其确定酶量，最后确定反应体积一个标准单位（U）的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲系统中，37℃反应一小时完全水解一微克pBR322 DNA所需的酶量因此，一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.0mg DNA 5ml、十倍的缓冲液2ml、酶1ml（十倍过量），无菌重蒸水12ml，反应总体积为20ml商品酶一般含有50%的甘油，为了确保甘油在反应体系中不对酶活性及专一性造成影响，酶的加入体积最好不要超过反应总体积的十分之。