生物制药工艺学第8章离子交换.ppt

第八章第八章 离子交换法离子交换法(ion-exchange)v第一节第一节  基本原理基本原理v离子交换法：利用溶液中离子交换法：利用溶液中带电粒子带电粒子与离子与离子交换剂之间交换剂之间结合力结合力的差异进行物质分离的的差异进行物质分离的操作方法操作方法v带电粒子与离子交换剂间的作用力是带电粒子与离子交换剂间的作用力是静电静电力力 v电荷密度、电荷种类电荷密度、电荷种类1离子交换剂离子交换剂v离离子子交交换换剂剂：：由由惰惰性性的的不不溶溶性性载载体体、、功功能能基基团团和和平平衡离子组成衡离子组成v阳离子交换剂：平衡离子带正电荷阳离子交换剂：平衡离子带正电荷v阴离子交换剂：平衡离子带负电荷阴离子交换剂：平衡离子带负电荷vR-X+ + Y+        R-Y+ + X+vR-表示阳离子交换剂的功能基团和载体；表示阳离子交换剂的功能基团和载体；X+ 为平衡为平衡离子；离子；Y+为交换离子为交换离子 2吸附吸附v选择性吸附选择性吸附：：调节溶液的调节溶液的pH值，值，使目的物带使目的物带有相当数量的静电荷，而主要杂质离子带相有相当数量的静电荷，而主要杂质离子带相反电荷或较弱的电荷。

反电荷或较弱的电荷v选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），便选择合适的树脂（如阳离子交换树脂），便可使目的物被离子交换树脂吸附，而杂质较可使目的物被离子交换树脂吸附，而杂质较少被吸附少被吸附 3洗脱洗脱v（（1））调节洗脱液的调节洗脱液的pH值值v（（2））用高浓度的同性离子将目的物离子取代用高浓度的同性离子将目的物离子取代下来v对阳离子交换树脂而言，目的物的对阳离子交换树脂而言，目的物的pI值愈大值愈大（愈碱），将其洗脱下来所需溶液的（愈碱），将其洗脱下来所需溶液的pH值也值也愈高 4离子交换树脂吸附和洗脱过程离子交换树脂吸附和洗脱过程v  （（1 1））X X+ +为平衡离子，为平衡离子，YHYH+ +及及Z Z+ +为待分离离子；为待分离离子；（（2 2））YHYH+ +和和Z Z+ +取代取代X X+ +而被吸附；而被吸附；（（3 3）加碱后）加碱后YHYH+ +失去正电荷，被洗脱；失去正电荷，被洗脱；（（4 4）提高）提高X X+ +的浓度取代出的浓度取代出Z Z+ + 动画动画5树脂的选择树脂的选择vpH大大于于等等电电点点时时，，物物质质带带负负电电荷荷，，与阴离子交换剂进行交换；与阴离子交换剂进行交换；vpH小小于于等等电电点点时时，，物物质质带带正正电电荷荷，，可以与阳离子交换剂进行交换。

可以与阳离子交换剂进行交换 6蛋白质等电点与所用交换剂蛋白质等电点与所用交换剂7离子交换技术的应用离子交换技术的应用8第二节第二节 离子交换树脂的结构和种类离子交换树脂的结构和种类 v离子交换树脂构成：离子交换树脂构成：v（（1）惰性的不溶性高分子固定骨架，称）惰性的不溶性高分子固定骨架，称载体载体v（（2）与载体）与载体共价键共价键连接的不能移动的活性基团，连接的不能移动的活性基团，又称又称功能基团功能基团v（（3）与功能基团以）与功能基团以离子键离子键连接的可移动的活性离连接的可移动的活性离子，亦称子，亦称平衡离子平衡离子 v如聚苯乙烯磺酸型钠树脂如聚苯乙烯磺酸型钠树脂9阳离子交换树脂分类阳离子交换树脂分类v强酸型树脂：磺酸型树脂，功强酸型树脂：磺酸型树脂，功能基团为磺酸根能基团为磺酸根(—SO3H)及甲及甲基磺酸根基磺酸根(—CH2SO3H)，，有好有好的解离能力的解离能力v中酸性树脂：磷酸型树脂（中酸性树脂：磷酸型树脂（—PO3H2  ））v弱弱酸酸性性树树脂脂：：羧羧酸酸型型树树脂脂和和酚酚型型树树脂脂（（—COOH ,           ）） ，，在在酸性环境中解离度受到抑制酸性环境中解离度受到抑制。

10阴离子交换树脂阴离子交换树脂v强碱型阴离子交换树脂：强碱型阴离子交换树脂：v          v弱弱碱碱型型阴阴离离子子交交换换树树脂脂：：活活性性基基团团为为伯伯、、仲仲、、叔叔胺胺基在碱性环境中解离度受到抑制在碱性环境中解离度受到抑制v中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类活性基团中强碱性阴离子交换树脂：兼有以上两类活性基团 11离子交换树脂功能基团的电离常数离子交换树脂功能基团的电离常数 12离子交换树脂的性能离子交换树脂的性能 13两性树脂：两性树脂：      蛇笼树脂蛇笼树脂(snake-cage resins)14离子交换树脂的命名：离子交换树脂的命名：v强酸类强酸类 1～～100号；号；v弱酸类弱酸类 101～～200；；v强碱类强碱类201～～300；；v弱碱类弱碱类301~400；；v中强酸类中强酸类401～～500v交交联联度度：：是是合合成成载载体体骨骨架架时时交交联联剂剂重重量量的的百百分分数数，，用用“×”将树脂编号与交联度分开将树脂编号与交联度分开v弱酸弱酸101 ×4其交联度为其交联度为4％v国内常用树脂命名：国内常用树脂命名：724；；732；；71715常用树脂v724；弱酸阳离子交换树脂；弱酸阳离子交换树脂v732；强酸阳离子交换树脂；强酸阳离子交换树脂v717；强碱阴离子交换树脂；强碱阴离子交换树脂16离子交换树脂的骨架离子交换树脂的骨架（一）苯乙烯型离子交换树脂（一）苯乙烯型离子交换树脂（一）苯乙烯型离子交换树脂（一）苯乙烯型离子交换树脂v由由苯苯乙乙烯烯与与二二乙乙烯烯苯苯经经过过氧氧苯苯甲甲酰酰催催化化聚聚合而成。

合而成v交联度交联度1718（二）丙烯酸型离子交换树脂丙烯酸型离子交换树脂丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸型阳离子交换树脂：是由丙烯酸甲酯丙烯酸甲酯与与二乙烯苯二乙烯苯经过氧苯甲酰催化聚合而成经过氧苯甲酰催化聚合而成19丙烯酸型阳离子交换树脂丙烯酸型阳离子交换树脂v110树脂：树脂：丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚合而成丙烯酸甲酯与二乙烯苯聚合而成v724树脂：树脂：它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲它是由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯和二乙烯苯三元共聚而得酯和二乙烯苯三元共聚而得 20（三）其它离子交换树脂（三）其它离子交换树脂 v蛇笼树脂蛇笼树脂：：脱盐脱盐 v螯形树脂螯形树脂：金属离子：金属离子 v吸附树脂吸附树脂 ：：““脱色树脂脱色树脂”” v热再生离子交换树脂：热再生离子交换树脂： 21常用离子交换树脂特性表常用离子交换树脂特性表 v 22第三节第三节 离子交换动力学离子交换动力学 v一、离子交换平衡一、离子交换平衡v                vR代代表表离离子子交交换换树树脂脂，，Z1及及Z2分分别别为为离离子子A1和和A2的的价电数v                         表示溶液中与树脂表面的两种离子。

表示溶液中与树脂表面的两种离子        23尼科尔斯基方程式尼科尔斯基方程式v用用m1、、m2及及C1、、C2分分别别代代表表树树脂脂上上和和溶溶液液中中的两种离子的浓度的两种离子的浓度v数量关系可表示数量关系可表示:v      v尼科尔斯基方程式尼科尔斯基方程式vK K＞＞1 1时时  离子离子A A1 1比离子比离子A A2 2对树脂有较大的吸引力对树脂有较大的吸引力 24二、离子交换速度二、离子交换速度vR－－B+ + A+          R－－A+ + B+v离子交换过程离子交换过程：：v1、、A+从溶液扩散到树脂表面从溶液扩散到树脂表面v2、、A+从从树树脂脂颗颗粒粒表表面面扩扩散散到到颗颗粒粒中中心v3、交换离子、交换离子A+ 与平衡离子与平衡离子B+交换v4、、B+从交换中心扩散到离子表面从交换中心扩散到离子表面v5、、B+ 再扩散到溶液中再扩散到溶液中25粒子扩散粒子扩散v速度：速度：v               颗粒孔径颗粒孔径、、v               颗粒半径颗粒半径、、v               树脂交换容量、树脂交换容量、v               离子离子A+的半径与电荷的半径与电荷、、v               平衡离子的性质（电荷、半径）。

平衡离子的性质（电荷、半径）26离子交换速度的影响因素：离子交换速度的影响因素：v1、、树脂粒度树脂粒度：树脂粒度大，交换速度慢树脂粒度大，交换速度慢v2、搅拌速度、搅拌速度v3、、树脂交联度树脂交联度：交联度大，交换速度低交联度大，交换速度低v4、、离离子子半半径径和和离离子子价价：：离离子子每每增增加加一一个个电电荷荷，，交换速度下降一个数量级交换速度下降一个数量级v5、温度v6、、离离子子浓浓度度：：交交换换速速度度随随离离子子浓浓度度的的上上升升而而加加快27三、离子交换动力学三、离子交换动力学v交换离子被吸附，平衡离子被释放交换离子被吸附，平衡离子被释放v交换带交换带：：交换离子交换离子A1由于被树脂吸附，其由于被树脂吸附，其浓度从起始浓度浓度从起始浓度Co逐渐下降到逐渐下降到0的树脂层的树脂层v交换带窄：交换带窄：K K＞＞1 1 ；；A A1 1浓度小；流速慢浓度小；流速慢  28第四节第四节 离子交换树脂的性能离子交换树脂的性能 v一、离子交换对树脂的基本要求一、离子交换对树脂的基本要求v二、影响树脂性能的几个因素二、影响树脂性能的几个因素v三、主要理化常数的测定三、主要理化常数的测定29一、离子交换对树脂的基本要求：一、离子交换对树脂的基本要求：v1、、有尽可能大的有尽可能大的交换容量交换容量。

v2、、有良好的有良好的交换选择性交换选择性v3、、化学性质稳定化学性质稳定v4、、化学动力学性能好化学动力学性能好v5、、物理性能好物理性能好30二、影响树脂性能的几个因素二、影响树脂性能的几个因素v1、、离离子子交交换换树树脂脂具具有有的的功功能能基基团团性性质质和和数数目目，，数目数目是其交换容量的基础是其交换容量的基础pH））v2、、树树脂脂的的交交联联度度——树树脂脂强强度度、、交交换换选选择择性、动力学性质性、动力学性质v3 3、、树脂骨架树脂骨架和和平衡离子平衡离子 31pH对交换容量的影响对交换容量的影响32 钠型树脂与氢型树脂钠型树脂与氢型树脂v偶极离子偶极离子vRSO3-Na+ + H3+NRCOO -      RSO3- H3+ NRCOO - +Na+  vRSO3- H + + H3+NRCOO -      RSO3- H3+ NRCOO Hv钠盐树脂钠盐树脂v氢型树脂氢型树脂，被取代的氢离子为羧基所固定，使被吸附，被取代的氢离子为羧基所固定，使被吸附的氨基酸不能形成偶极，与树脂之磺酸基没有排斥力的氨基酸不能形成偶极，与树脂之磺酸基没有排斥力v与钠型树脂相比，与钠型树脂相比，氢型树脂氢型树脂有较有较大大的有效的有效交换容量交换容量。

 33三、主要理化常数的测定三、主要理化常数的测定v1 1、、含含水水量量：：常常用用干干燥燥法法和和离离心法心法测得v2 2、、膨胀度膨胀度：膨胀系数：膨胀系数K K膨胀膨胀v3．．湿湿真真密密度度－－树树脂脂充充满满水水时时的密度v4.4.交换容量交换容量:meq/g :meq/g 树脂34交换容量测定方法交换容量测定方法v阳阳离离子子交交换换树树脂脂（（氢氢型型））的的测测定定方方法法：：一一定定量量树树脂脂中中加加入入NaOH溶溶液液，，一一天天或或数数天天后后测测定定NaOH剩余量，从剩余量，从消耗的碱量消耗的碱量求交换容量求交换容量v阴阴离离子子交交换换树树脂脂（（氯氯型型））的的测测定定方方法法：：一一定定量量树树脂脂装装柱柱，，用用过过量量Na2SO4溶溶液液进进行行离离子子交交换换，，测定测定流出液中氯离子总量流出液中氯离子总量，求交换容量求交换容量35滴定曲线：滴定曲线：36滴定曲线滴定曲线1 1．强酸树脂．强酸树脂Amberlite IR-120Amberlite IR-120；；2 2．弱酸树脂．弱酸树脂Amberlite IRC-84Amberlite IRC-84；；3 3．强碱树脂．强碱树脂Amberlite IRA-400Amberlite IRA-400；；4 4．弱碱树脂．弱碱树脂Amberlite IR-45Amberlite IR-45强酸强碱树脂有水平段强酸强碱树脂有水平段转折点位置转折点位置功能团种类功能团种类交换容量随交换容量随pH值变化值变化37第五节第五节 离子交换的选择性离子交换的选择性 v影响离子交换选择性的因素：影响离子交换选择性的因素：v                离子价与离子水合半径离子价与离子水合半径v                离子价与离子浓度离子价与离子浓度v                交换环境交换环境v                树脂结构树脂结构v                偶极离子排斥偶极离子排斥38一、离子的化合价与水合半径的影响：一、离子的化合价与水合半径的影响：v相对亲和力相对亲和力和相对浓度。

和相对浓度v电荷效应越强的离子与树脂的亲和力越电荷效应越强的离子与树脂的亲和力越大，而决定电荷效应的主要因素是大，而决定电荷效应的主要因素是价电价电数和离子半径数和离子半径39v一价阳离子亲和力的次序是：一价阳离子亲和力的次序是：vH+≈Li+＜＜Na+＜＜K+≈ NH4+ ＜＜Ag+ v对对强碱性强碱性树脂阴离子亲和力次序：树脂阴离子亲和力次序：vF－－＜＜OH－－ ＜＜HCOO－－ ＜＜Cl－－＜＜Br－－＜＜I－－＜＜SO4 2-v对对弱碱性弱碱性树脂阴离子亲和力次序：树脂阴离子亲和力次序：vF－－＜＜Cl－－＜＜Br－－=I－－=Ac－－＜＜ SO4 2- ＜＜OH－－40离子交换树脂的性能离子交换树脂的性能 41强酸强碱树脂对各种离子的选择系数 v H+≈Li+＜＜Na+＜＜K+≈ NH4+ ＜＜Pb+＜＜Cs+＜＜Ag+＜＜Ti+ 42二、二、离子化合价与离子浓度的影响：离子化合价与离子浓度的影响：v设设离离子子平平衡衡后后溶溶液液中中两两种种离离子子的的浓浓度度比比是是定定值值P.P.v C C1 1/C/C2 2=P=Pv在在稀稀溶溶液液(C(C2 2较较小小) )中中，，树树脂脂吸吸附附高高价价离离子子的的倾向很大倾向很大。

 43举例举例v例如：例如：v当当k=2  P=1  m1+m2=1 C2Z2=1时时v若若Z1=2   则则m1，，m2v若若Z1=3   则则m1，，m2v在较稀的溶液中，树脂几乎仅吸附高价离子在较稀的溶液中，树脂几乎仅吸附高价离子44三、交换环境的影响三、交换环境的影响v1、、溶溶液液的的pH：：解解离离度度、、交交换换容容量量、、选择性v2、、离离子子强强度度：：交交换换容容量量、、选选择择性性、、交换速度交换速度v3、、有有机机溶溶剂剂：：能能降降低低有有机机离离子子的的解解离程度45四、树脂结构的影响四、树脂结构的影响  （一）（一）树脂载体的交联度树脂载体的交联度：：v交交联联度度上上升升，，膨膨胀胀度度下下降降，，K值值增增大大，，树树脂潜在的选择能力提高脂潜在的选择能力提高v空空隙隙大大小小的的影影响响，，即即膨膨胀胀度度增增大大，，促促使使树树脂吸附量增加脂吸附量增加v选选择择性性的的影影响响，，膨膨胀胀度度增增大大时时，，K值值减减小小，，促使树脂吸附量降低；促使树脂吸附量降低；v膨胀系数值很小时，空间效应占主要地位膨胀系数值很小时，空间效应占主要地位v膨胀系数增大到一定值时，选择性占主要膨胀系数增大到一定值时，选择性占主要地位。

地位图8.14 磺酸基树脂吸附土霉素的量与树脂膨胀度之间的关系46膨胀度与选择性的关系膨胀度与选择性的关系      图图8.12  在在甲甲基基丙丙烯烯酸酸—丙丙烯烯酰酰胺胺树树脂脂，，链链霉霉素素与与钠钠离离子子交交换换等等温温线线与与树脂膨胀度的关系树脂膨胀度的关系 1— 1—膨胀系数膨胀系数1.91.9；； 2— 2—膨胀系数膨胀系数3 3；； 3— 3—膨胀系数膨胀系数4.54.5；； 4— 4—膨胀系数膨胀系数5.25.2；； m m1 1——树脂对链霉素吸附量；树脂对链霉素吸附量； C C1 1，，C C2 2——溶液中链霉素和钠离子浓度溶液中链霉素和钠离子浓度47v（（二二））辅辅助助力力：：离离子子交交换换树树脂脂与与被被吸吸附附离离子子间间的的作用力除静电力外，还存在一种辅助力作用力除静电力外，还存在一种辅助力v无机离子交换常数无机离子交换常数K值多在值多在1~10之间v有机离子交换时，有机离子交换时，K值可高达值可高达102~103。

v（三）（三）其它结合力：某些树脂对金属离子有特殊其它结合力：某些树脂对金属离子有特殊的亲和力的亲和力 v羧酸型树脂羧酸型树脂 48  五、偶极离子排斥作用：五、偶极离子排斥作用：v偶极离子偶极离子vRSO3-Na+ + H3+NRCOO -     RSO3- H3+ NRCOO - +Na+  vRSO3- H + + H3+NRCOO -       RSO3- H3+ NRCOO Hv钠盐树脂钠盐树脂v氢型树脂氢型树脂v与钠型树脂相比，与钠型树脂相比，氢型树脂氢型树脂有较有较大大的有效的有效交换容量交换容量 49氢型与钠型磺酸基树脂吸附氨基酸比较氢型与钠型磺酸基树脂吸附氨基酸比较 50第六节第六节 离子交换操作方法离子交换操作方法 v一、一、 树脂的选择树脂的选择v目目的的物物是是弱弱酸酸性性或或弱弱碱碱性性的的小小分分子子物物质质时时，，宜宜选选用用强强酸酸强强碱碱树树脂脂（（氨氨基酸的分离）基酸的分离）v蛋白质、酶蛋白质、酶和和其它生物大分子其它生物大分子的分的分离多采用离多采用弱碱或弱酸性树脂弱碱或弱酸性树脂，减少，减少生物大分子的变性，利于洗脱，提生物大分子的变性，利于洗脱，提高选择性。

高选择性 51  二、树脂的处理和再生二、树脂的处理和再生1 1、、    外观特征外观特征v透透明明或或半半透透明明；；颗颗粒粒圆圆整整，，粒粒度度均匀，强度均匀，强度v2 2、、    树脂的预处理树脂的预处理v（（1 1））        物理处理：去杂，过筛物理处理：去杂，过筛v（（2 2）） 化学处理化学处理：用：用8 8～～1010倍的倍的1mol/L 1mol/L 盐酸或氢氧化钠溶液交盐酸或氢氧化钠溶液交替浸泡替浸泡 52氨基酸分离前树脂的处理氨基酸分离前树脂的处理53不同类型树脂的处理不同类型树脂的处理54树脂的再生树脂的再生  树树脂脂再再生生：：使使用用过过的的树树脂脂重重新新获获得得使使用用性性能能的的处处理理过程  再生过程：再生过程：v（（1）） 去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质去杂，大量水冲洗，除去物理吸附的杂质v（（2）） 用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质v (3) (3) 转型：转型：55三、基本操作方法三、基本操作方法v交换：交换：静态交换静态交换  动态交换动态交换v洗洗脱脱方方式式：：分分静静态态洗洗脱脱及及动动态态洗洗脱脱两两种种，，pH及离子强度改变。

及离子强度改变v洗脱液：洗脱液：酸、碱、盐酸、碱、盐56v酸、碱洗脱液酸、碱洗脱液目的是改变目的是改变吸附物的电荷吸附物的电荷或或改改变树脂活性基团变树脂活性基团的解离状态，以消除静电结的解离状态，以消除静电结合力，迫使目的物被释放出来；合力，迫使目的物被释放出来；v盐类洗脱液盐类洗脱液是通过高浓度的同种电荷的离子是通过高浓度的同种电荷的离子与目的物与目的物竞争竞争树脂上的活性基团，使吸附物树脂上的活性基团，使吸附物游离 57洗脱方式洗脱方式v动态洗脱：动态洗脱：v   1、、 溶液溶液pH及离子强度不变及离子强度不变v   2、分阶段改变溶液、分阶段改变溶液pH及离子强度及离子强度v   3、、连续改变溶液连续改变溶液pH及离子强度及离子强度v梯度洗脱梯度洗脱：：自动化的梯度仪自动化的梯度仪58梯度洗脱梯度洗脱v梯度混合器梯度混合器:v A瓶为低浓度盐溶液瓶为低浓度盐溶液v B瓶为高浓度盐溶液瓶为高浓度盐溶液vC=CA―（（CA―CB））VAA/AB 浓度梯度曲线浓度梯度曲线59第七节第七节  应用实例应用实例v分离纯化分离纯化——氨基酸制备氨基酸制备v无盐水制备无盐水制备60氨基酸制备、分离氨基酸制备、分离v猪血粉水解制备猪血粉水解制备6种氨基酸种氨基酸:61无盐水制备无盐水制备v无无盐盐水水制制备备是是利利用用氢氢型型阳阳离离子子交交换换树树脂脂和和羟羟型型阴阴离离子子交交换换树树脂脂的的组组合合以以除除去去水水中中所所有有的的离子离子，其反应式如下：，其反应式如下：62无盐水制备无盐水制备v阳阳离离子子交交换换树树脂脂用用强强酸酸性性树树脂脂，，阴阴离离子子交交换换树树脂脂可可以以用用强强碱碱或或弱碱弱碱树脂。

树脂v强强酸酸——弱弱碱碱 或或 强强酸酸——强强碱；碱；v强酸强酸—弱碱弱碱—强酸强酸—强碱强碱；；v强酸强酸——强碱强碱——混合床混合床63混合床混合床v混混合合床床系系将将阳阳、、阴阴两两种种树树脂脂混混合合而而成成，，脱盐效果好脱盐效果好v混合床中所发生的反应混合床中所发生的反应:64混合床－无盐水混合床－无盐水图8.20 混合床的操作(a)为水制备时的情形；(b)为制备结束，用水逆流冲洗阳、阴树脂根据比重不同分层，阳树脂较重在阳、阴树脂根据比重不同分层，阳树脂较重在下面，阴树脂在上面；下面，阴树脂在上面；(c)为上部、下部同时通入碱、酸再生，废液自中间排出；(d)为再生结束，通入空气，将阳、阴树脂混合、准备制水 65混合床－抗生素脱盐混合床－抗生素脱盐v经经过过第第一一柱柱（（阳阳树树脂脂））时时，，溶溶液液变变酸酸，，而而经经过过第第二二柱柱（（阴阴树树脂脂））时时，，溶溶液液又又变变碱v链链霉霉素素脱脱盐盐：：强强酸酸1×25和和弱弱碱碱311×4树树脂组成混合床，脱盐效果较好脂组成混合床，脱盐效果较好66第八节第八节 新型离子交换剂新型离子交换剂 v一、大孔、均孔树脂一、大孔、均孔树脂v（一）（一）大孔型离子交换树脂大孔型离子交换树脂（（macro porous ,MP））v（二）均孔型离子交换树脂（二）均孔型离子交换树脂 ( IR )v二、多糖基离子交换剂二、多糖基离子交换剂v（一）（一）离子交换纤维素离子交换纤维素v（二）（二）葡聚糖凝胶离子交换剂葡聚糖凝胶离子交换剂67大孔型与凝胶型离子交换树脂物理性质大孔型与凝胶型离子交换树脂物理性质68（一）大孔型离子交换树脂的特征（一）大孔型离子交换树脂的特征 v（（1）载体骨架交联度高。

载体骨架交联度高v（（2））孔径大孔径大v（（3））表表面面积积大大，，表表面面吸吸附附强强，，对对大大分分子物质的交换容量大子物质的交换容量大v（（4）孔隙率大孔隙率大69大孔型离子交换树脂主要特性 70（二）（二）均孔型离子交换树脂均孔型离子交换树脂v主要是主要是阴离子交换树脂阴离子交换树脂v骨骨架架的的交交联联度度比比较较均均匀匀代代号号为为IP或或IRv交交联联度度均均匀匀，，孔孔径径大大小小一一致致，，交交换换容容量都较高，膨胀度、机械强度好量都较高，膨胀度、机械强度好71二、多糖基离子交换剂 v生物大分子对离子交换的要求生物大分子对离子交换的要求: : 固相载体具有固相载体具有亲水性亲水性和较大的和较大的交换空间交换空间; ;v 对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱对其生物活性有稳定作用，并便于洗脱v生物来源稳定的高聚物生物来源稳定的高聚物————多糖作载体多糖作载体v多糖基离子交换剂可以分为：多糖基离子交换剂可以分为：v 离子交换纤维素离子交换纤维素v 葡聚糖离子交换剂葡聚糖离子交换剂 72（一）离子交换纤维素（一）离子交换纤维素特点：特点：v(1)(1)开放的长链骨架，开放的长链骨架，亲水性强亲水性强，表面积大，易，表面积大，易吸附大分子吸附大分子。

v(2)(2)交换交换基团稀疏基团稀疏，对大分子的实际交换容量大对大分子的实际交换容量大 v(3)(3)吸附力弱，吸附力弱，交换和洗脱条件缓和交换和洗脱条件缓和，不宜变性不宜变性v(4)(4)分辨率高分辨率高73常用的离子交换纤维素常用的离子交换纤维素v羧甲基纤维素（羧甲基纤维素（CM-C）：弱）：弱酸性阳离子交换纤维素，酸性阳离子交换纤维素，pK=3.6 v二乙基氨基乙基纤维素二乙基氨基乙基纤维素（（DEAE-C）：强碱型阴离子）：强碱型阴离子交换纤维素，交换纤维素，pK=9.174v 75离子交换纤维素的制备离子交换纤维素的制备 v 76操作注意点操作注意点v可静态交换，也可动态交换可静态交换，也可动态交换v交换基团密度低、吸附力弱交换基团密度低、吸附力弱v盐浓度不宜高盐浓度不宜高（控制在（控制在 mol/L）） 77离子交换纤维素的选择离子交换纤维素的选择—解离曲线解离曲线78离子交换纤维素的解吸离子交换纤维素的解吸 v洗脱缓和洗脱缓和v升高环境的升高环境的pH、降低、降低pH或是增加离子强度都能将或是增加离子强度都能将被吸附物质洗脱下来被吸附物质洗脱下来v 79离子交换纤维素的处理和再生离子交换纤维素的处理和再生 v酸酸碱碱浓浓度度要要适适当当降降低低，，处处理理时时间间也也从从4h缩缩短短为为0.3~1h。

v以交换缓冲液平衡以交换缓冲液平衡v注意：注意：v不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制不耐酸，用酸处理的浓度和时间须小心控制80（二）（二）葡聚糖凝胶离子交换剂葡聚糖凝胶离子交换剂v是将是将活性交换基团活性交换基团连接于连接于葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶上制成的各种上制成的各种交换剂交换剂 v命名命名: :v交换活性基团交换活性基团- -Sephadex C (A)- -编号v具有具有离子交换和分子筛离子交换和分子筛的双重作用，对生物分子有的双重作用，对生物分子有很高的分辨率很高的分辨率 81常用离子交换葡聚糖v 82琼脂糖凝胶离子交换剂琼脂糖凝胶离子交换剂v琼脂糖凝胶上引入功能基琼脂糖凝胶上引入功能基vDEAE —sepharose CL-6BvCM —sepharose CL-6BvDEAE—ToyopearlvCM—Toyopearl83多糖基离子交换剂应用——尿激酶分离纯化尿激酶分离纯化84思考题v请以请以DEAE-C为例说明离子交换纤维素分离为例说明离子交换纤维素分离纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各纯化蛋白质时的洗脱方法有哪些？并说出各种方法的洗脱原理种方法的洗脱原理。

 85第九节第九节 离子交换聚焦色谱离子交换聚焦色谱 v色色谱谱聚聚焦焦（（chromatofocusing））: 是是一一种种高高分分辨辨的的新新型型的的蛋蛋白白质质纯纯化化技技术术是是根根据据蛋蛋白白质质的的等等电电点点，，结结合合离离子子交交换换技技术术的的大大容容量量色色谱谱，，能能分分离离几几百百毫毫克克蛋蛋白白质质样样品品，，洗洗脱脱峰峰被被聚焦效应浓缩，分辨率高聚焦效应浓缩，分辨率高v适用适用水溶性的两性分子水溶性的两性分子，如蛋白质、酶、多，如蛋白质、酶、多肽、核酸等肽、核酸等 86一、色谱聚焦的原理一、色谱聚焦的原理v（一）（一）自动形成自动形成pH梯度梯度v（二）（二）蛋白质的色谱行为蛋白质的色谱行为v（三）（三）聚焦效应聚焦效应 87PH梯度溶液的形成梯度溶液的形成v在在聚焦层析聚焦层析中，中，当洗脱液流进当洗脱液流进多多缓冲交换剂缓冲交换剂时，时，由于交换剂带有由于交换剂带有缓冲能力的电荷缓冲能力的电荷基团，故基团，故PH梯度梯度溶液可以自动形溶液可以自动形成成88PBE94柱聚焦色谱的柱聚焦色谱的pH梯度梯度n（（1））柱内每点的柱内每点的PH值从高到低逐渐下降值从高到低逐渐下降。

n（（2）从层析柱顶部到）从层析柱顶部到底部就形成了底部就形成了PH6～～9的梯度n（（3））PH梯度会逐渐梯度会逐渐向下迁移向下迁移n（（4））底部流出液的底部流出液的PH由由9逐渐降至逐渐降至689蛋白质的色谱行为蛋白质的色谱行为v当当柱柱中中PH低低于于蛋蛋白白质质的的PI时时，，蛋蛋白白质质带带正正电电荷荷，，不不与与阴阴离离于交换剂结合于交换剂结合,随洗脱液向下移动随洗脱液向下移动 v当当蛋蛋白白质质移移动动至至环环境境PH高高于于其其PI时时，，蛋蛋白白质质由由带带正正电电荷荷变变为带负电荷为带负电荷，并与，并与阴离子交换剂结合阴离子交换剂结合v由由于于洗洗脱脱剂剂的的通通过过，，蛋蛋白白质质周周围围的的环环境境PH 再再次次低低于于PI时时，，它又带它又带正电荷正电荷，并，并从交换剂解吸下来从交换剂解吸下来而下降而下降 v移至移至pH大于大于PI时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出时又重新结合，直至蛋白质从柱下流出v v不不同同蛋蛋白白质质具具有有不不同同的的等等电电点点，，在在被被离离子子交交换换剂剂结结合合以以前前，，移动距离移动距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。

是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的90聚焦效应聚焦效应v当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移当一种蛋白质在柱上随洗脱液下移至等电点处时，移动速度明显减慢至等电点处时，移动速度明显减慢v此时加上此时加上相同相同的的第二个样品第二个样品，它将，它将以洗脱液移动的速度下降，直至追以洗脱液移动的速度下降，直至追到正在慢移的第一个样品（到正在慢移的第一个样品（聚焦聚焦）v如果加入的第二个样品的等电点比如果加入的第二个样品的等电点比第一个样品高，它可以越过第一个第一个样品高，它可以越过第一个样品区先被洗脱出来样品区先被洗脱出来 91二、多缓冲剂 v多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是多缓冲剂是一种两性电解质缓冲剂，是分子分子量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合量大小不同的多种组分的多羧基多氨基化合物物vPolybuffer96             PBE94vPolybuffer74             PBE9492三、多缓冲交换剂 vPBE94是是以以交交联联琼琼脂脂糖糖6B（（Sepharose 6B））为为载载体体，，并并在在糖糖基基上上通通过过醚醚键键偶偶合合上上配配基基制制成成的的多缓冲交换剂，是多缓冲交换剂，是阴离子交换剂阴离子交换剂。

v当当Polybuffer96流流进进多多缓缓冲冲交交换换剂剂时时，，PH梯梯度度溶液可以自动形成（溶液可以自动形成（9—6））93四、操作步骤 v（一）凝胶和缓冲剂的选择（一）凝胶和缓冲剂的选择 vPBE94          Polybuffer96vPBE94          Polybuffer74vpH间隔为间隔为3个单位vpH范围应包含要分离样品各组分等电点范围应包含要分离样品各组分等电点，，并使其有并使其有2/3~1/2柱长的吸附解吸时间柱长的吸附解吸时间 94（二）凝胶柱的准备（二）凝胶柱的准备v（（1）凝胶按）凝胶按1∶ ∶1悬浮于悬浮于起始缓冲液起始缓冲液中，除气泡中，除气泡v（（2））柱柱垂垂直直除除底底部部尼尼龙龙网网下下的的气气泡泡，，关关闭闭柱柱下下端端出口v（（3））在在柱柱中中放放2~3ml起起始始缓缓冲冲液液，，搅搅拌拌下下缓缓缓缓倒倒入v（（4））打打开开柱柱底底部部开开关关，，待待凝凝胶胶沉沉降降后后将将柱柱顶顶部部接接头装好v（（5）用）用10~15个柱床体积个柱床体积起始缓冲液平衡起始缓冲液平衡95（三）、样品的准备（三）、样品的准备v100mg蛋白质蛋白质/ /10ml床体积。

床体积v样品体积不超过样品体积不超过个床体积个床体积 96（四）、上样和洗脱（四）、上样和洗脱v样品均匀平整地加到床面上；样品均匀平整地加到床面上；v上样前应先加上样前应先加5ml洗脱液洗脱液v用洗脱缓冲液淋洗，用洗脱缓冲液淋洗，pH梯度自动形成梯度自动形成v梯梯度度的的pH上上限限由由起起始始缓缓冲冲液液确确定定，，其其下限由淋洗缓冲液的下限由淋洗缓冲液的pH决定决定97去除多缓冲剂的方法去除多缓冲剂的方法v（（1））沉淀法沉淀法v（（2））凝胶过滤凝胶过滤v（（3）亲和色谱法）亲和色谱法  v（（4）疏水色谱法）疏水色谱法 98多缓冲离子交换剂的再生多缓冲离子交换剂的再生v多缓冲交换剂的再生可以在柱上进行多缓冲交换剂的再生可以在柱上进行v用用2~3个床体积的个床体积的1mol/L NaCl淋洗v用用mol/L HCl洗涤99100五、应用实例-蛋白质模拟混合物分离蛋白质模拟混合物分离蛋白质模拟混合物分离蛋白质模拟混合物分离vPBE94柱柱，床高，床高15cmv样样品品:4ml洗洗脱脱缓缓冲冲液液含含有有马马肌肌红蛋白，碳酸酐酶和白蛋白红蛋白，碳酸酐酶和白蛋白.v起起始始缓缓冲冲液液:mol/L咪咪唑唑HCl，，pH7，，v洗洗脱脱缓缓冲冲液液：：多多缓缓冲冲剂剂74，，pH4。

101离子交换剂 v弱酸弱酸阳离子交换阳离子交换树脂树脂           724v强酸强酸阳离子交换阳离子交换树脂树脂           732v强碱强碱阴离子交换阴离子交换树脂树脂 717vCM-CvDEAE-CvCM-Sephadex C vDEAE-Sephadex Av？？-Sepharose A -Sepharose A （（聚焦色谱聚焦色谱PBE94PBE94 ））102思考题v1、、影影响响树树脂脂性性能能的的因因素素有有离离子子交交换换树树脂脂具具有有的的           、、           和和            v2 2、、写写出出下下列列离离子子交交换换剂剂类类型型：：732732 ，，724724 ，，717717 ，，CM-CCM-C ,DEAE-C ,DEAE-C ，，PBE94PBE94 v3 3、、在在采采用用多多缓缓冲冲阴阴离离子子交交换换剂剂作作固固定定相相的的离离子子交交换换聚聚焦焦色色谱谱过过程程中中，，当当柱柱中中某某位位点点之之pHpH值值下下降降到到蛋蛋白白质质组组分分 值值以以下下时时，，它它因因带带 电电荷荷而而 ，，如如果果柱柱中中有有两两种种蛋蛋白白组组分分，，pIpI值值较较 者者会会超超过另一组分，移动至柱下部过另一组分，移动至柱下部pHpH较较 的位点进行的位点进行 。

v4、、影响离子交换选择性的因素主要有影响离子交换选择性的因素主要有        、、        、、        、、        、、        等v5、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为、用钠型阳离子交换树脂处理氨基酸时，吸附量很低，这是因为 （（   ））v   A. . 偶极排斥偶极排斥     B. .离子竞争离子竞争     C. . 解离低解离低     D. . 其它其它v6、、在在尼尼柯柯尔尔斯斯基基方方程程式式中中，，K值值为为离离子子交交换换常常数数，， K＞＞1说说明明树树脂脂对对交交换换离子吸引力（离子吸引力（   ）v   A. . 小于平衡离子小于平衡离子      B. .大于平衡离子大于平衡离子      C. . 等于平衡离子等于平衡离子     D. . 其它其它 103。