人DDR2基因pShuttleCMV穿梭载体的构建及表达.doc

1人 DDR2 基因 pShuttleCMV 穿梭载体的构建及表达作者：任婷婷，刘新平，车红磊，张健，张璟，李霞，苏金 【摘要 】 目的：构建带有 flag 标签的人 DDR2 pShuttle CMV载体， 检测其真核表达并观察 DDR2 分子的亚细胞分布 . 方法：以含有人全长 DDR2 cDNA 的质粒为模板，用 PCR 方法扩增 DDR2基因的 C 端（DDR2 C ） ，并在其 C 末端带上含 24 bp 的 flag 标签，Nco I/EcoR V 酶切后亚克隆入含有 DDR2 全长序列的pMD18 T 载体，即替换掉原有 DDR2 序列的 C 端，引入 flag 标签，测序正确后再克隆入 pShuttle CMV 表达载体，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染 HEK293 细胞，Western Blot 检测DDR2 flag 在细胞中的表达. 瞬时转染 Hela 细胞，通过间接免疫荧光法观察 DDR2 分子在细胞内的分布情况. 结果：测序及酶切显示 DDR2 flag/pShuttle CMV 载体构建符合预期；脂质体法转染HEK293 细胞，24 h 后用 Western Blot 方法检测到目的蛋白的表达；对转染了目的载体的细胞应用 FITC 标记的抗体进行间接免疫荧光实验，激光共聚焦显微镜观察到 DDR2 分子主要分布于细胞质与细胞膜. 结论：成功构建并表达了 C 末端带 flag 标签的 DDR2 真核表达载体，使其在真核细胞中表达，并观察到其亚细胞分布. 2【关键词】 聚合酶链式反应0 引言盘状结构域受体 2（discoidin domain receptor 2，DDR2）属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTKs)，可被天然纤维型胶原活化，从而介导基质金属蛋白酶（MMP 1 ，MMP 8 ，MMP 13 ）的表达［ 1-2］. DDR2 在类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平，而其所活化的下游分子中，特别是 MMP 13 对关节软骨的主要成分 II 型胶原的降解能力高于其他胶原酶，因此认为“Ⅱ型胶原 DDR2 MMPs” 通路中的关键分子可能成为减轻 RA 关节软骨破坏的药物作用靶位［3 ］. 然而目前有关此通路的研究报道甚少，我们构建 C 末端融合 flag 标签的人 DDR2 基因真核表达载体，旨在为进一步研究 DDR2 信号通路在RA 中的影响奠定基础.1 材料和方法1．1 材料大肠杆菌菌株 XL 10，pcDNA3.1(+) 真核表达载体，含人全长 DDR2 cDNA 的质粒，HEK293 细胞及 Hela 细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存. 3dNTP，dATP ，pfu 高保真聚合酶，Taq DNA 聚合酶，各种限制性内切酶，pMD18 T 载体，T4 DNA 连接酶，DL2000 DNA marker（日本 TaKaRa 公司） ；DMEM 培养基（美国 Gibco 公司） ；Lipofectamine 2000（美国 Invitrogen 公司） ；抗 flag M2 mAb（美国 Sigma 公司） ；抗 DDR2 抗体及 FITC 标记的羊抗鼠第二抗体（美国 Santa Cruz 公司） ；Western Blot 所用发光底物（美国 Pierce 公司） ，其他试剂均为国产分析纯. 用于 PCR 反应的引物由北京三博远志生物公司合成，质粒提取和 DNA 回收试剂盒由安徽优晶生物工程公司提供.1．2 方法1．2．1 引物设计 DDR2 C 上游引物序列：5′ GTC ACC ATG GAC CTG CTC TCA GG 3′， 其中 CCA TGG 为位于 DDR2序列 1631 bp 处的 Nco I 酶切位点；下游引物序列： 5′ GAA TTC GAT ATC TCA CTT GTC ATC ATC GTC CTT GTA ATC CTC GTC GCC TTG TTG AAG GA 3′，GAA TTC 为 EcoR I 酶切位点，GAT ATC 为 EcoR V 酶切位点，其中前者可用于将 DDR2 C（含 flag）的 PCR 产物克隆入 pMD18 T 载体，后者用于将带有 flag 标签的DDR2 全长序列亚克隆入 pShuttle CMV 载体，下划双线部分为编码 flag 标签的核苷酸序列.41．2．2PCR 扩增 DDR2 C（含 flag）基因及产物修饰扩增条件为 94℃ 5 min， 94℃ 40 s，55℃ 40 s, 72℃ 1 min，30 个循环. 产物用 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收后进行加“A”反应：72℃ 40 min.1．2．3PCR 产物克隆及序列测定加 “A”后的 PCR 产物回收，克隆到 pMD 18T 载体，转化大肠杆菌 XL 10 感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定并测序.1．2．4DDR2 全序列拼接及鉴定用 Nco I/EcoR I 双酶切DDR2 C/pMD 18T，得到含 flag 的 DDR2C 端，置换出pMD18 T 载体中不含 flag 标签的 DDR2 C 端，并进行酶切鉴定，即在 pMD18 T 载体中完成含有 flag 的新 DDR2 全长序列的拼接.1．2．5 真核表达载体的构建用 Hind III/EcoR V/Sca I 三酶切含有拼接 DDR2 序列的 pMD18 T 载体，其中 Hind III/EcoR V可切下完整的 DDR2 序列（2568 bp） ，Sca I 将余下的 pMD18 T载体(2692 bp)切割为两个小片段(924 bp+1768 bp)，便于电泳分离.1．2．6 基因转染 HEK293 细胞在含 100 mL/L 新生小牛血清的 DMEM 培养基中，于 37℃ ，50 mL/L CO2 饱和湿度下培养，580％汇合时按照 Lipofectamine2000 说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染.1．2．7Western Blot 检测转染后细胞中目的基因的表达转染后 24 h 裂解细胞收集总蛋白，取 20 μg 处理后的蛋白样品进行SDS PAGE 电泳并电转移至 NC 膜，5 g/L 脱脂奶粉封闭 1 h，与适当稀释后的一抗 4℃ 孵育过夜，TBST 洗膜，与 l∶4000 稀释的FITC 标记的二抗室温孵育 l h，TBST 洗膜后加入发光底物孵育 1 min，X 光片曝光，显影，定影.1．2．8 间接免疫荧光观察 DDR2 亚细胞定位 Hela 细胞在含 100 mL/L 新生小牛血清的 DMEM 培养基中，于 37℃，50 mL/L CO2 饱和湿度下培养， 80％汇合时按照 Lipofectamine2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染，于转染 24 h 后收细胞，40 mL/L 多聚甲醛 4℃固定 15 min，10 mL/L TritonX 100 室温孵育 10 min，用含 10 mL/L BSA 的一抗（1∶100 稀释）4℃ 过夜，FITC 标记的二抗（1∶100 稀释）室温孵育 2 h，核染料 PI 37℃孵育 5 min，甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察.2 结果2.1DDR2 C（含 flag）片段的扩增、克隆及序列分析6DDR2 C（含 flag）的 PCR 产物为 937 bp 的特异性条带（图1A）. 测序结果经 Blast 分析表明， PCR 扩增获得并克隆的DDR2 C 片段序列完全正确. 通过位于片段内的 BamH I 与 T 载体多克隆位点处的 Hind III 进行双酶切，可切出预期大小的片段，分别为 343， 594，2692 bp 的三条带（图 1B）.图 1PCR 产物及重组载体的鉴定　略2.2DDR2 全长片段的拼接拼接后的 DDR2flag/PMD18 T用 Nco I/EcoR V 酶切，可见切出 937 bp 的目的片段（图 2）.图 2DDR2flag/PMD18 T 重组质粒的酶切鉴定　略2.3DDR2flag/pShuttle CMV 真核表达载体的构建拼接成功后的 DDR2flag 片段经 Hind III/EcoR V 双酶切，回收 2592 bp的片段连入真核载体 pShuttle CMV，用 DDR2 序列内部的两个BamH I 酶切位点鉴定，构建成功可见切出 1029 bp 的目的片段，反之则没有（图 3）.2.4 真核表达载体 DDR2flag/pShuttle CMV 在 HEK293 细胞中的表达构建成功的 DDR2flag/pShuttle CMV 和空质粒pShuttle CMV 分别瞬时转染 HEK293 细胞，转染后 24 h 用抗flag 抗体检测 DDR2flag 在蛋白水平的表达，而对照的空质粒转染7后则没有相应的条带（图 4）.2.5DDR2 的亚细胞定位将构建的重组表达载体DDR2flag/pShuttle CMV 瞬时转染 Hela 细胞，激光共聚焦显微镜可观察到作为膜受体的 DDR2 分子主要分布于胞膜及胞质近膜处，也发现其存在少量胞核分布（图 5）.图 3－图 5　略3 讨论由于 DDR2 是 RA 病理进程中的关键分子，因此对其所进行的研究，无论是体内还是体外水平，都需要高表达且易于检测的工具载体. 我们构建的 DDR2flag/pShuttle CMV 载体与以往工具载体的不同在于：一方面，它是腺病毒包装的穿梭载体，可用于DDR2 相关腺病毒的包装，无论在 RA 滑膜细胞还是动物模型中都能达到一般真核表达载体所不具备的高转染/感染效率；同时其所携带的 flag 标签也大大提高了目的基因的检测灵敏性和特异性.有研究发现 ［4-5 ］ ， DDR1 在胶原刺激下与 Src 结合后发生自身磷酸化，继而被基质金属蛋白酶水解为氨基端外功能区及酪氨酸磷酸化的胞内羧基残段(CTF)，目前推测被剪切掉的胞外功能区8可能有着竞争结合并中止胶原配体持续发挥作用的负反馈功能，但同属盘状结构域受体家族的 DDR2 存在此现象的文献报道尚少 . 有趣的是， 我们在观察 DDR2 亚细胞定位时发现其存在少量胞核分布（图 5C 箭头所示） ， 这提示， DDR2 很可能与 DDR1 一样有着类似的限制性蛋白水解现象， 这也预示着 DDR2 除具有膜受体功能外， 在信号转导过程中可能还具有更为复杂的作用.我们以含有人 DDR2 全长 cDNA 的质粒为模板，通过 PCR法获得了 C 末端融合有 flag 标签的人 DDR2 基因，并构建了DDR2 flag 基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞HERK293 中能够正确表达定位，这为进一步研究 DDR2 功能奠定了基础.【参考文献】［1］ Olaso E, Labrador JP, Wang L, et al. Discoidin domain receptor 2 regulates fibroblast proliferation and migration through the extracellular matrix in association with transcriptional activation of matrix metalloproteinase 2［J］. J Biol Chem, 2002, 277(5): 3606-3613.9［2］ Xu L, Peng H, Wu D, et al. Activation of the discoidin domain receptor 2 induces expression of matrix metalloproteinase 13 associated with osteoart。