DNA高级结构理化性质及应用课件.ppt

一、一、DNADNA的双螺旋结构及其意义的双螺旋结构及其意义 1953年，年，Watson和和Crick发现发现了了DNA双螺旋（双螺旋（double helix)结构模型结构模型DNA DNA双螺旋结构要点双螺旋结构要点：(WatsonWatson和和CrickCrick，1953)1953)1.1.DNA DNA 由两条反相平行的脱氧核苷酸由两条反相平行的脱氧核苷酸链组成，脱氧核糖链组成，脱氧核糖-磷酸骨架位于磷酸骨架位于双链的外侧，碱基位于内侧，双链双链的外侧，碱基位于内侧，双链的碱基之间以氢键相结合的碱基之间以氢键相结合碱基互补配对形式：碱基互补配对形式：A A T T；G G C)C)2.DNA2.DNA是右手螺旋结构，螺旋直径为是右手螺旋结构，螺旋直径为2nm2nm，螺距为螺距为3.43.4nmnm碱基平面垂直碱基平面垂直螺旋轴，相邻碱基平面距离为螺旋轴，相邻碱基平面距离为0.340.34nmnm，螺旋一圈包含螺旋一圈包含1010对碱基3.3.氢键维持氢键维持DNADNA双链横向稳定性，碱双链横向稳定性，碱基堆积力维持双链纵向稳定性基堆积力维持双链纵向稳定性图图1-8 DNA双螺旋结构示意图双螺旋结构示意图 上述上述WatsonWatson和和CrickCrick的DNADNA双螺旋结双螺旋结构称为构称为B B型结构，是型结构，是DNADNA分子在生理条分子在生理条件下最稳定的结构，如果改变溶液的件下最稳定的结构，如果改变溶液的离子强度或相对湿度，离子强度或相对湿度，DNADNA螺旋结构螺旋结构的上述特征就会发生变化。

的上述特征就会发生变化右手螺旋右手螺旋，11 11 碱基碱基/螺旋螺旋右手螺旋右手螺旋，10 10 碱基碱基/螺旋螺旋左手螺旋左手螺旋，12 12 碱基碱基/螺旋螺旋可能参与基因的可能参与基因的表达和调控表达和调控 DNA DNA双螺旋结构不同构型的意义并不在双螺旋结构不同构型的意义并不在于其螺旋直径及其高度的变化，关键是于其螺旋直径及其高度的变化，关键是由于这些变化而引起的表面结构的改变，由于这些变化而引起的表面结构的改变，进而影响其生物学功能进而影响其生物学功能DNADNA双螺旋的这种表面结构有助于双螺旋的这种表面结构有助于DNADNA结结合蛋白识别并结合特定的合蛋白识别并结合特定的DNADNA序列而这序列而这种表面构型的变化对基因组种表面构型的变化对基因组DNADNA与其与其DNA DNA 结合蛋白的特异性相互作用具有重要的结合蛋白的特异性相互作用具有重要的意义二、其它类型的二、其它类型的DNADNA高级结构高级结构1 1、三股螺旋、三股螺旋DNADNA 三股螺旋三股螺旋DNA也称三链也称三链DNA（triple strand DNA,tsDNA),其结构是在其结构是在DNA双双螺旋结构的基础上形成。

螺旋结构的基础上形成双螺旋通过双螺旋通过Watson-Crick氢键稳定，而氢键稳定，而三股螺旋沿需通过三股螺旋沿需通过Hoogsteen氢键稳定氢键稳定三条链均为同型嘌呤三条链均为同型嘌呤（homopurine,Hpu)或同型嘧淀或同型嘧淀（homopyrimidine,Hpy),即整段的碱基均即整段的碱基均为嘌呤或嘧啶为嘌呤或嘧啶根据三链的组成和相对位置分为两种基根据三链的组成和相对位置分为两种基本类型：本类型：嘌呤嘌呤-嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（Pu-Pu-Py型型)：嘧啶嘧啶-嘌呤嘌呤-嘧啶型（嘧啶型（Py-Pu-Py型型)：在碱性介质中稳定在碱性介质中稳定在偏酸性介质中稳定在偏酸性介质中稳定 三链中的两条链为正常双螺旋，第三条三链中的两条链为正常双螺旋，第三条嘧啶链位于双螺旋的大沟中，并随双螺旋嘧啶链位于双螺旋的大沟中，并随双螺旋结构一起旋转结构一起旋转三链中碱基配对符合三链中碱基配对符合Hoogsteen模型：模型：在在Py-Pu-Py型中为：型中为：T=A=T、C+=G=C（与（与G形成形成Hoogsteen键的键的C必须质子化）；必须质子化）；在在Pu-Pu-Py中为：中为：G=G=C、A=A=T 当当DNA双链中含有双链中含有H-回文序列时，即某回文序列时，即某区段区段DNA两条链分别为两条链分别为Hpu和和Hpy，并且，并且各自为回文结构时，任一条回文结构的各自为回文结构时，任一条回文结构的5 和和3部分都可以形成分子内三股螺旋及剩余的部分都可以形成分子内三股螺旋及剩余的半条回文游离单链。

半条回文游离单链在一定条件下，含回文序列在一定条件下，含回文序列DNA还可形成小瘤还可形成小瘤DNA（nodule DNA),它在中性溶液中稳定它在中性溶液中稳定真核生物基因组中存在大量可形成三链真核生物基因组中存在大量可形成三链DNA的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷的多聚嘌呤核苷酸和多聚嘧啶核苷酸序列这些序列有的存在于调控区，酸序列这些序列有的存在于调控区，有的位于有的位于DNA复制的起点或终点，有的复制的起点或终点，有的则位于染色体重组位点，则位于染色体重组位点，提示它们可能提示它们可能与基因的表达调控、与基因的表达调控、DNA的复制及染色的复制及染色体的重组有关体的重组有关2 2、十字型结构、十字型结构 十字型结构的分子基础是十字型结构的分子基础是DNADNA分子中存在翻分子中存在翻转重复序列转重复序列此时不仅两条链互补单链中的翻转重复区此时不仅两条链互补单链中的翻转重复区也可以互相配对形成双链分子也可以互相配对形成双链分子DNADNA变性后或因其他原因引起变性后或因其他原因引起DNADNA分子两条链分子两条链分开，再复性时翻转重复区的分开，再复性时翻转重复区的DNADNA可以自我配可以自我配对，形成突出于双链之外的发夹结构，两个并对，形成突出于双链之外的发夹结构，两个并列的发夹形成十字结构。

列的发夹形成十字结构5 5 TCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCTCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGC AGGCCGTTTGTTTGTGGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACG 5 AGGCCGTTTGTTTGTGGGCGACCATCGCCACCAAAAAAACAAACG 5 G GG TG TTACGGCCGCGATCGCGATATATTATATAGCGCTAGCGCCGGCATC AC A C C5 5-TCCGGCAAAC TTTTGTTTGC-TCCGGCAAAC TTTTGTTTGC-AGGCCGTTTG AAAACAAACG-5 -AGGCCGTTTG AAAACAAACG-5 与与DNADNA双螺旋结构相比双螺旋结构相比,十字形结构十字形结构中氢键形成减少中氢键形成减少,而且失去了双螺旋而且失去了双螺旋DNADNA碱基堆积力的相互作用碱基堆积力的相互作用,因而稳定因而稳定性不如双螺旋性不如双螺旋DNA.DNA.十字形结构可能在基因表达调控中十字形结构可能在基因表达调控中起作用起作用,但其确切的生物学功能有待但其确切的生物学功能有待研究研究.3.DNA3.DNA的超螺旋结构的超螺旋结构 DNA DNA双螺旋进一步盘曲形成更加复杂的双螺旋进一步盘曲形成更加复杂的结构称为结构称为DNADNA的三级结构的三级结构,即超螺旋结构即超螺旋结构.正超螺旋正超螺旋:DNA:DNA的盘曲方向与的盘曲方向与DNADNA双螺旋双螺旋方向相同方向相同.负超螺旋负超螺旋:DNA:DNA的盘曲方向与的盘曲方向与DNADNA双螺旋双螺旋方向相反方向相反.(1)(2)核小体核小体核心组蛋白核心组蛋白第一层次折叠，体积减第一层次折叠，体积减少少6倍。

倍第二层次折叠，直径第二层次折叠，直径30nm纤丝，每纤丝，每周周6个核小体，致密度增加个核小体，致密度增加40倍第三层次折叠，第三层次折叠，30nm纤丝折叠成柱纤丝折叠成柱状结构致密度增加约状结构致密度增加约1000倍在分裂期的染色体中，约在分裂期的染色体中，约1m长的长的DNA分子约压缩分子约压缩8 000-10 000倍，容纳于直径倍，容纳于直径只有数微米的细胞核中只有数微米的细胞核中超螺旋可能有两方面的生物学意义:超螺旋DNA比松驰型DNA更紧密,使DNA分子体积变得更小,对其在细胞的包装过程更为有利;超螺旋能影响双螺旋的解链程序,因而影响DNA分子与其他分子(如酶、蛋白质）之间的相互作用三、三、DNADNA的理化性质及应用的理化性质及应用(一一)双链双链DNA单链单链DNA(二二)在在DNADNA解链过程中，由于更多的解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，共轭双键得以暴露，DNADNA在紫外区在紫外区260nm260nm处的吸光值增加，并与解链处的吸光值增加，并与解链程度有一定的比例关系，这种关系程度有一定的比例关系，这种关系称为称为DNADNA的的增色效应增色效应三三)四、核酸分子杂交的应用四、核酸分子杂交的应用1、RNA酶保护分析（酶保护分析（Ribonuclease Protection Assay,RPA)RPA RPA是以液相杂交为基础发展起来的，可用于基因和是以液相杂交为基础发展起来的，可用于基因和mRNAmRNA的的结构分析以及结构分析以及mRNAmRNA的定量研究。

的定量研究其原理为：其原理为：在体外经转录合成一个带有标记的单链在体外经转录合成一个带有标记的单链RNARNA探针，探针，此探针与待测此探针与待测RNARNA在序列上互补，二者杂交后，用在序列上互补，二者杂交后，用RNARNA酶处理，酶处理，未形成双链的未形成双链的RNARNA单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链RNARNA受到保护，不被降解，然后通过电泳进行受到保护，不被降解，然后通过电泳进行RNA-RNARNA-RNA杂交体的检测杂交体的检测RPARPA的检测方法十分灵敏，结果可靠，是进行的检测方法十分灵敏，结果可靠，是进行mRNAmRNA定量、定量、mRNAmRNA末端定位以及确定内含子位置的常用方法末端定位以及确定内含子位置的常用方法总总RNARNA标记探针标记探针杂交杂交RNARNA酶酶水解水解灭活灭活RNARNA酶酶沉淀沉淀RNARNAPAGEPAGE电泳电泳膜转移膜转移与生物素与生物素探探针针杂交杂交洗膜、封闭洗膜、封闭膜与抗生物素蛋白膜与抗生物素蛋白-碱碱性磷酸酶一起孵育性磷酸酶一起孵育加入发光剂加入发光剂X X光片曝光光片曝光RNA酶保护分析示意图：酶保护分析示意图：2 2、滤膜杂交：、滤膜杂交：滤膜杂交是固相杂交的一种，是将待测核酸分子滤膜杂交是固相杂交的一种，是将待测核酸分子结合到不同的滤膜上，然后同存在于液相中的标记结合到不同的滤膜上，然后同存在于液相中的标记探针进行杂交。

探针进行杂交待测核酸样品可以直接点在滤膜上（称为斑点杂待测核酸样品可以直接点在滤膜上（称为斑点杂交）；也可以先将核酸样品经琼脂糖凝胶电泳分离，交）；也可以先将核酸样品经琼脂糖凝胶电泳分离，再通过再通过印迹技术印迹技术将核酸从凝胶中按原来的位置和顺将核酸从凝胶中按原来的位置和顺序转移到滤膜上这样可以比较准确地保持待测核序转移到滤膜上这样可以比较准确地保持待测核酸片段在电泳图谱中的位置，同时又可以进行分子酸片段在电泳图谱中的位置，同时又可以进行分子量测定这一技术通常用于这一技术通常用于DNADNA的限制性内切酶图谱分析、的限制性内切酶图谱分析、判断判断DNADNA的限制性内切酶片段长度多态性以及的限制性内切酶片段长度多态性以及DNADNA的的定性、定量等研究定性、定量等研究3 3、原位杂交、原位杂交(in situ hybridization)(in situ hybridization)：原位杂交是用标记探针与细胞或组织原位杂交是用标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交切片中的核酸进行。