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第五章 人工诱发单倍体及其应用培养对象 花药药培养、花粉培养 子房培养、胚珠培养、胚培养、胚乳培养 离体受精第一节 花药和花粉培养二倍体(diploid )植物其单倍体（haploid）即一倍体（monoploid ）如， 玉米 2n = 2x = 20 n= x = 10； 水稻 2n = 2x = 24 n= x = 12四倍体(tetraploid)植物其haploid为dihaploid如，马铃薯 2n = 4x = 48， n = 2x = 24六倍体(hexaploid)植物其haploid为triploid 如，普通小麦2n = 6x = 42， n = 3x = 21八倍体(octoploid)植物其haploid为tetraploid如，草莓 2n = 8x = 56 ，n = 4x = 28单单倍体(haploid)是不是就是一倍体呢？单单倍体(haploid)指具有配子体（gametophyte）染色体数的孢子体(植物个体)(sporophyte) 体细细胞染色体数减半；单单倍体植物与二倍体相比较较，有三个明显显的特点： 生长发长发 育弱，体形小、各器官明显显减小； 雌雄配子严严重败败育，有的甚至不能进进入有性 世代。

（二）花药或花粉培养在作物育种中的作用：供体植株小孢子（N）花粉培养花粉植株（N）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株（2N）（1）缩缩短育种年限：常规规育种需4-6年获获得纯纯系，而小孢孢子培养仅仅需1-2年一年内获得纯系例：二倍体供体植株基因型为为AaBb，若要从后代中选择选择 基因为为AAbb的纯纯合单单株常规规方法： AAbb出现现的概率为为1/16，并且不能将AAbb与Aabb、aAbb区分开2）提高了目标标基因型的选择选择 效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb例：二倍体供体植株基因型为为AaBb，若要从后代中选择选择 基因为为AAbb的纯纯合单单株单单倍体方法： AAbb出现现的概率为为1/4 单倍体 二倍体AB- - AABBaB- aaBBAb- AAbbab- - aabb供体亲本AaBb花粉培养（2）提高了目标标基因型的选择选择 效率 植株不受显隐显隐 性的影响，在诱变诱变 育种中能在当代及时获时获 得突变变个体，加倍后成为稳为稳 定的纯纯系。

利于筛选隐筛选隐 性突变变体 提高诱变诱变 效率3）诱变诱变 育种中的作用（4） 利于获获得优优良植株 如：芦笋全雄系的培育（5）用作基础础研究的各个领领域花药的结构及花粉管的形成花药的结构及花粉粒的发育2NN减数分裂 四分体 4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） 单核花粉粒（单核靠边期） （两者仅以质膜相隔） 精细胞 生殖细胞（小） 有丝分裂 （2-细胞花粉粒） 精细胞 (3-细胞花粉粒）N双核早期（三）花药和花粉培养中雄核发育的途径 1、A途径 小孢孢子第一次有丝丝分裂为为不均等分裂，形成营营养细细胞和生殖细细胞 （1）A-V途径 由营营养细细胞重复分裂形成单单倍体 （2）A-G途径 由生殖细细胞重复分裂形成单单倍体 （3）A-VG途径（E途径） 由营营养细细胞和生殖细细胞各自独立分裂，共同形成单单倍体 （4）C途径 营营养细细胞和生殖细细胞通过过核融合，形成多倍体植株2、B途径 小孢孢子第一次有丝丝分裂为为均等分裂，形成大小相近的两个细细胞然后由这这两细细胞连续连续 分裂形成单单倍体植株，或者核融合形成多倍体植株三）花药和花粉培养中雄核发育的途径（四）花药培养与花粉培养的异同点 培养目的相同，均获获得小孢孢子植株。

花药药培养属于器官培养；而花粉培养属于细细胞培养 花粉培养没有药药壁组织组织 干扰扰，单单倍体产产量高一）研究历史： 首先报道通过花药培养获得单倍体植株成功的是印度学者Guha和Maheshwari (1964, 1966) 1996年的统计数据表明,已有至少250多种植物花药培养成功 花药培养获得单倍体的技术途径已在禾本科作物、茄科作物、十字花科作物的育种中广泛应用二、 花药培养技术（二）花药药培养的基本程序是：外植体选择消毒剥取花药接种诱导培养植株再生q外植体的选择：供试材料的遗传背景，供试材料的生理状态，花粉的发育时期等 四分体 4个单核花粉粒（细胞壁薄、细胞质浓、核位于细胞中央） 营养细胞（大） 单核花粉粒（单核靠边期） （两者仅以质膜相隔） 精细胞 生殖细胞（小） 有丝分裂 （2-细胞花粉粒） 精细胞 (3-细胞花粉粒）N双核早期 选择选择 花药时药时 ，一般通过镜检过镜检 来确定其中的花粉是否处处于适宜的发发育期 最常用的方法有醋酸洋红红法但是，某些植物的花粉细细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾铬矾 法，这这种方法能将花粉细细胞核染成蓝蓝黑色Different flower stages as used in anther culture. Stage 2 is the optimum stage of developmentfor use in tobacco anther culture（二）花药药培养的基本程序是：外植体选择选择 消毒剥取花药药接种诱导诱导 培养植株再生q花药药的剥取：避免花药药受到损伤损伤 ，因为损伤为损伤 常会刺激花药药壁组织组织 的发发育，形成二倍体的愈伤组织伤组织 。

p花药预处药预处 理 大量试验结试验结 果表明，花药药培养前给给予一定的低温处处理是十分必要的q 花药药培养常用的基本培养基： N6：高硝态态氮，低铵态铵态 氮，广泛用于禾本科植物的花药药培养 B5、MS、White、Nitch 等 C17（王培等，1986）：适于小麦花药药培养，提高 出愈率激素：相对较对较 低的激素水平蔗糖：一般2-3%，高浓浓度对对禾谷类较类较 有利 番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应蔗糖浓度 2 3 4 6 10 13 17诱导频 率 5 10 12 18 25 45 8q培养条件温度和光照：三、花粉培养技术 1、取材时时期：四分体时时期到单单核早期 2、花粉的分离： 3、小孢孢子纯纯化： 对获对获 得的小孢孢子混合物进进行分级过筛级过筛 、梯度离心处处理纯纯化小孢孢子 4、花粉的培养1）自然散落法(漂浮培养自然释释放法) ： 将花药药接种在预处预处 理液或液体培养基上，待花粉自动动散落后，收集培养2）机械游离法 a.磁搅搅拌法：用磁力搅搅拌器低速搅搅拌培养液中的花药药，使花粉游离出来； b.挤压挤压 法：在烧烧杯或研钵钵中挤压挤压 花药药，将花粉挤挤出后收集培养。

花粉培养方法 1、平板培养：花粉置琼琼脂固化培养基上培养 2、液体培养： 花粉悬悬浮在液体培养基中培养，需震荡荡，以利通气 3、双层层培养：先铺铺一层琼层琼 脂固体培养基（加入失活花药药的浸提液），凝固后，在表面加入少量液体培养基培养 4、看护护培养：利用花药药或花药药愈伤组织释伤组织释 放出的活性物质质促进进花粉小孢孢子发发育 5、微室培养：利用小的盖玻片和凹穴载载玻片形成微室进进行花粉培养看护培养图解1、胚状体发育途径：小孢孢子经历经历 胚发发生的各个阶阶段，最后子叶展开，形成花粉植株四、花粉植株的形态发生方式烟草花药药培养通过过胚状体途径再生形成小植株1、胚状体发育途径：小孢孢子经历经历 胚发发生的各个阶阶段，最后子叶展开，形成花粉植株2、愈伤组织发育途径：小孢孢子分裂数次形成愈伤伤，再分化形成花粉植株此途径产产生的植株会出现变现变 异且倍性复杂杂四、花粉植株的形态发生方式愈伤组织转 接种到再生培养基愈伤组织 分化形成再生植株部分花药产 生愈伤组织接种在平板上的水稻花药水稻花药培养的愈伤化发生途径五、花粉植株的倍性及染色体加倍1. 对对花粉再生植株群体进进行鉴鉴定的必要性：体细细胞干扰扰生殖细细胞的自发发加倍2. 花粉植株的倍性： 单单倍体、二倍体、多倍体、非整倍体3. 影响非整倍体植株出现现的频频率的因素： 植株的种类类 接种花粉的发发育时时期 培养基中激素的浓浓度和种类类 花粉植株发发生的方式 愈伤组织继伤组织继 代培养时间长时间长 短五、花粉植株的倍性及染色体加倍五、花粉植株的倍性及染色体加倍4. 单单倍体植株的鉴鉴定 1）形态态学鉴鉴定 2）染色体分析5. 单单倍体植株的二倍化 小苗浸泡法 生长锥处长锥处 理 培养基加倍六、花药和花粉培养中的白花苗白化苗的控制 花粉发发育时时期：花药药培养中，白花苗的比例随接种时时花粉发发育时时期的延迟迟而提高。

培养基成分：高浓浓度的2,4-D会使花粉愈伤组织伤组织分化出更多的白化苗培养温度：当培养温度提高时时，白花苗的数目也随之增加。